SET-iFISH檢測(cè)技術(shù)在原發(fā)乳腺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)中的初步研究.pdf

1、目的:
　　在許多實(shí)體腫瘤中，對(duì)表面標(biāo)志物的表達(dá)以及倍體分析的技術(shù)（SET-iFISH檢測(cè)技術(shù)）已被證實(shí)成為檢測(cè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells，CTCs）的敏感性很高的方法，而在乳腺癌特別是原發(fā)性乳腺癌中的相關(guān)研究甚少。因此我們通過(guò)SET-iFISH檢測(cè)技術(shù)來(lái)檢測(cè)原發(fā)性乳腺癌中的CTCs，并通過(guò)細(xì)胞角蛋白(cytokeratin，CK)以及倍體的表達(dá)情況來(lái)得出CTCs亞型的特征，從而分析乳腺癌中的CT

2、Cs及其相關(guān)特性，以期為乳腺腫瘤的早期監(jiān)測(cè)、腫瘤分子分型、療效評(píng)價(jià)、預(yù)后指導(dǎo)、腫瘤風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、個(gè)體化治療等一系列過(guò)程提供更為精確有力的檢測(cè)手段。
　　方法:
　　在2014.02至2015.06間，我們?nèi)虢M了長(zhǎng)海醫(yī)院甲乳外科184例原發(fā)性乳腺癌患者，26例乳房良性腫瘤患者及10例健康志愿者。在該研究中分別抽取以上患者及健康志愿者的未經(jīng)任何治療的外周血樣本。所有項(xiàng)目均可提供知情同意書(shū)，該試驗(yàn)經(jīng)過(guò)長(zhǎng)海醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過(guò)且根據(jù)赫

3、爾辛基宣言的原則進(jìn)行。
　　該試驗(yàn)參考了相關(guān)臨床試驗(yàn)以及制造商的說(shuō)明(Cytelligen，San Diego，CA，USA)[3、15]。首先，用ACD抗凝管(Becton Dickinson，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ，USA)采集7.5ml患者血樣本，然后與3ml hCTC分離介質(zhì)充分混勻，在室溫下用450×g進(jìn)行離心5分鐘。免疫磁性微粒偶聯(lián)抗白細(xì)胞單克隆抗體包括抗CD45抗體后緩慢振蕩10分鐘并提取上層清液并培養(yǎng)。

4、隨后用一種磁性分離技術(shù)(Promega，Madison，WI)去除白細(xì)胞，在室溫下磁性顆粒以500×g緩慢離心2分鐘。細(xì)胞顆粒在細(xì)胞固定劑中徹底重懸并覆蓋于CTC表面而后被應(yīng)用到后續(xù)iFISH的分析。對(duì)于CK-iFISH方法，樣本由Alexa Fluor594-共軛單克隆抗CD45和Alexa Fluor488-共軛抗PanCK(CK4、5、6、8、10、13及18)或抗人表皮生長(zhǎng)因子受體2(human epidermal growth

5、 factor receptor-2，HER2)的聯(lián)合抗體在黑暗中聯(lián)合免疫標(biāo)記1小時(shí)，使用FISH技術(shù)S500 StatSpinThermoBrite Slide雜交/變性系統(tǒng)(Abbott Molecular, Des Plaines，IL，USA)的8號(hào)染色體著絲粒探針8(CEP—8) SpectrumOrange(Vysis, Abbott Laboratories，Abbott Park，IL，USA)，非整倍體上DAPI+/C

6、D45-/PanCK+/-/HER2+者被認(rèn)為是CTCs。
　　采用SPSS19.0(IBM，NY, USA)的軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。采用U檢驗(yàn)對(duì)乳腺癌，乳房良性疾病及健康志愿者之間CTCs數(shù)量的不同進(jìn)行分析。包含或不包含CK表達(dá)的CTCs陽(yáng)性率由Fisher's精確檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。應(yīng)用OriginPro8 SR08.0版(Northampton，MA，USA)進(jìn)行圖表生成。所有的檢測(cè)數(shù)據(jù)均采用雙側(cè)檢驗(yàn)，且認(rèn)為P值小于0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)

7、意義(P＜0.05)。
　　結(jié)果:
　　1.CTCs與乳腺癌
　　在2014.02至2015.06間，總共入組了上海市長(zhǎng)海醫(yī)院甲乳外科184例原發(fā)乳腺癌患者，26例乳房良性腫瘤患者及10例健康志愿者。184例乳腺癌患者中167例可檢測(cè)到非整倍體CTCs(90.76％)，其中CTC的數(shù)量為0-19/7.5ml血（均值2）。檢測(cè)出的CTC總數(shù)為676，其中三倍體的數(shù)量為387(57.25％)，來(lái)源于147例患者(147/1

8、67，79.89％)。而其中僅18例患者(18/167，10.78％)中的33個(gè)CTC被檢出CK+(4.88％)。26例良性腫瘤中8例(30.77％)可檢測(cè)出非整倍體CTC，明顯少于乳腺癌患者(P=0)。此外，良性腫瘤中CTC的檢出率均＜3/7.5ml血。而健康志愿者的血樣本中均未檢測(cè)出CTC。
　　2.CTCs與腫瘤大小
　　在184例被檢測(cè)的乳腺癌樣本中，158例的腫瘤大小可測(cè)量。其中根據(jù)腫瘤直徑的最大徑來(lái)看，80例≤2

9、cm（歸為T(mén)1期），68例＞2 cm且≤5cm（歸為T(mén)2期），而10例＞5cm（歸入T3期）。盡管T3期的患者所占比例少，但其在組間CTC的檢出率最多（0-18，均值5.5）。三倍體CTC的數(shù)量在T3期和T1/T2期患者中明顯不同，均值分別為4、1.5和1(P=0.048，P=0.006)?；贑K表達(dá)不同的CTC亞型在T1、T2及T3期患者中無(wú)顯著差異。
　　3.CTCs與乳腺癌分子分型[17]
　　在184例乳腺癌樣本中

10、，166例的激素受體狀態(tài)已知。其中根據(jù)乳腺癌分子分型來(lái)看，30例屬于Luminal A型(ER+和/或PR+，且HER2-，且Ki-67＜14％=，89例為L(zhǎng)uminal B型(ER+和/或PR+，且HER2+; ER+和/或PR+，且HER2-，且Ki-67≥14％)，35例HER2陽(yáng)性型(ER-且PR-且HER2+)，以及12例三陰性(ER-且PR-且HER2-)。發(fā)現(xiàn)存在CTCs的人數(shù)中，LuminalA型占30例中的28例(80

11、％)，數(shù)值范圍為0-18/7.5ml血（均值2），Luminal B型的患者中占89例的80例(89.9％)，數(shù)值范圍為0-19/7.5ml血(均值2)，而在HER2陽(yáng)性型患者中占35例中的34例(97.1％)，數(shù)值范圍為0-15/7.5ml血（均值4），另外三陰性患者12例均發(fā)現(xiàn)CTCs的存在(100％)，數(shù)值范圍在0-12/7.5ml血（均值2.5）。HER2陽(yáng)性型和三陰性的乳腺癌患者與Luminal A型和Luminal B型者相

12、比，檢測(cè)到CTCs的頻率及數(shù)量均相對(duì)較高。
　　CTCs亞型基于染色體核型，包括三倍體，四倍體及其他多倍體(≥5)，能在不同激素受體狀態(tài)的乳腺癌中體現(xiàn)類(lèi)似的分布。而CK+的CTCs主要存在于Luminal A和Luminal B的患者中。
　　結(jié)論:
　　SET-iFISH系統(tǒng)可用于檢測(cè)非轉(zhuǎn)移性的不依賴(lài)CK表達(dá)的乳腺癌CTCs。CTCs存在與否及其數(shù)量與乳腺癌的腫瘤大小以及激素受體狀態(tài)密切相關(guān)。而在不考慮腫瘤大小以及激