MERS-CoV主要結(jié)構(gòu)蛋白小鼠單抗的制備及抗棘突(S)蛋白不同區(qū)段單抗的鑒定與應(yīng)用.pdf

1、背景：
　　中東呼吸綜合征冠狀病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus, MERS-CoV）是2102年發(fā)現(xiàn)的可引起人類重癥呼吸道感染的一種新型冠狀病毒，目前感染范圍已波及27個國家，主要集中在中東地區(qū)和韓國，其致死率也超過SARS-CoV，達(dá)到了36％左右。然而目前并沒有有效的可用于MERS-CoV感染治療和預(yù)防的措施。
　　MERS-CoV是一類有包膜單股正鏈 RNA

2、病毒，屬于冠狀病毒屬 C亞群，基因組全長約30kb，主要包括纖突（spike，S）蛋白，包膜（envelope，E）蛋白，膜（membrane，M）蛋白和核衣殼（nuclecapsid，N）蛋白四種結(jié)構(gòu)蛋白。其中S蛋白作為MERS-CoV重要的囊膜蛋白，以三聚體的形式存在病毒膜表面，在病毒感染宿主細(xì)胞過程中發(fā)揮著重要作用，是病毒疫苗及相關(guān)抗體治療藥物研究設(shè)計的重要位點;主要包括S1和S2兩個重要的亞單位；S1亞單位通過其受體結(jié)合區(qū)（re

3、ceptor binding domain, RBD）介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞表面DPP4受體識別，S2亞單位通過其構(gòu)象改變后形成的六股螺旋束結(jié)構(gòu)介導(dǎo)膜融合過程的發(fā)生。 N蛋白主要參與病毒的遺傳物質(zhì)的復(fù)制過程，常作為MERS-CoV血清學(xué)診斷的主要結(jié)構(gòu)蛋白。M蛋白和E蛋白在病毒的形態(tài)發(fā)生和裝配過程中發(fā)揮著重要作用。
　　S1亞基的RBD區(qū)是MERS-CoV單抗及疫苗研究設(shè)計的重要位點，目前，不同的研究團(tuán)隊篩選到了針對此病毒的中和單抗，其

4、作用表位幾乎都位于S1亞基的RBD區(qū)域。事實上，S蛋白作為一種天然空間構(gòu)象結(jié)構(gòu)，RBD區(qū)域外的其他結(jié)構(gòu)域在病毒感染過程中一定也起著某種重要的作用，本研究中MERS-CoVS1亞基的NTD（N-terminal domain of S1 subunit）區(qū)域以及S2亞基區(qū)域中和單抗的發(fā)現(xiàn)就證實了這個觀點，提示不同中和機(jī)制在MERS-CoV感染過程中存在的可能性。除此之外，不同種類的MERS-CoV疫苗也逐漸被研制出來，但由于疫苗制備、保存

5、及免疫方式等的不同，其批內(nèi)或批間免疫效果存在一定的差異性，而建立有效的疫苗定量檢測平臺將能順利解決這個問題，本研究中，基于RBD蛋白單抗ELISA雙抗體夾心法的建立為此檢測平臺的建立提供了可能。
　　研究目的：
　　通過免疫小鼠制備大批單克隆抗體，從中篩選出特異針對MERS-CoV核衣殼（N）蛋白及棘突（S）蛋白的單克隆抗體；對篩選出的抗S不同區(qū)域的單抗進(jìn)行生物學(xué)特性分析，可為MERS-CoV的血清學(xué)診斷和疫苗研發(fā)提供技術(shù)支

6、持，同時為病毒感染入侵與中和機(jī)制研究提供參考。
　　研究方法及結(jié)果：
　　一、 MERS-CoV S與NP蛋白小鼠單抗的制備
　　本實驗通過小鼠免疫、雜交瘤細(xì)胞融合技術(shù)及 ELISA檢測技術(shù)的應(yīng)用篩選能穩(wěn)定分泌抗MERS-CoV S和N蛋白的單抗細(xì)胞株，接著將S單抗統(tǒng)一定量為1μg/ml,驗證其中和MERS-CoV假病毒和結(jié)合MERS-CoV不同區(qū)段重組蛋白rS1、rS2、rRBD和rNTD ELISA能力。結(jié)果顯示：

7、20株單抗針對RBD區(qū)域，其中6株單抗中和假病毒能力達(dá)到90%以上，4株達(dá)到50%~90%之間；5株單抗針對NTD區(qū)域，其中3株單抗中和假病毒能力達(dá)到50%~90%之間；3株單抗針對S2區(qū)域，其中1株單抗中和假病毒能力達(dá)到50%~90%之間；3株針對S1亞基的RBD、NTD外區(qū)域，中和假病毒能力均小于50%；除此之外，3株單抗具有交叉結(jié)合不同重組蛋白現(xiàn)象，其中2株單抗中和假病毒能力達(dá)到50%~90%之間。
　　二、基于RBD單抗E

8、LISA雙抗體夾心法建立
　　疫苗是預(yù)防病毒感染的重要手段，而有效的疫苗質(zhì)量監(jiān)測評價方法的建立將對疫苗研發(fā)提供重要技術(shù)支持。應(yīng)用合作科室自主研發(fā)的熒光免疫層析檢測平臺，對34株單抗進(jìn)行熒光標(biāo)記，與未標(biāo)記的單抗相互配對檢測MERS-CoV rS蛋白，其中M1C12F4與M4E8C5單抗配對組合顯示出了最高的靈敏度；接著將單抗M1C12F4與M4E8C5用辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記后與未標(biāo)記的M4E8C5與M1C12F4進(jìn)行配對檢測

9、不同濃度MERS-CoV rS蛋白，同時對實驗室現(xiàn)有的滅活MERS-CoV病毒、HKU1-OC43病毒、MHV病毒、SARS-CoV假病毒和HKU1-S1蛋白進(jìn)行了初步檢測；最后對配對單抗與 rRBD蛋白結(jié)合親和力和 MERS-CoV中和能力進(jìn)行了生物學(xué)特性分析。實驗結(jié)果顯示，單抗組合M1C12F4作為捕獲抗體、M4E8C5作為標(biāo)記抗體配對組合表現(xiàn)出極高的MERS-CoV rS檢測靈敏度和特異度，其最低檢測濃度達(dá)到0.06μg/ml；此

10、配對抗體對其他冠狀病毒和相應(yīng)的蛋白的初步檢測結(jié)果均顯示陰性；同時這兩株單抗均能有效的與MERS-CoV rRBD蛋白結(jié)合及中和MERS-CoV病毒感染，具有很好的應(yīng)用前景。
　　三、MERS-CoV NTD、S2單抗生物學(xué)特性分析
　　為了深入了解作用于NTD和S2區(qū)域單抗的中和作用特點，對篩選到的具有MERS-CoV假病毒中和能力的3株NTD單抗和1株S2單抗分別驗證了其在不同濃度下與rNTD、rS2的結(jié)合親和力以及中和M

11、ERS-CoV假病毒和活毒感染的能力。同時應(yīng)用Western blot技術(shù)驗證了NTD單抗與變性重組蛋白 rNTD的結(jié)合能力，接著對可疑線性表位 NTD單抗驗證了其18aa肽ELISA結(jié)合特點。實驗結(jié)果顯示NTD、S2中和單抗均可有效的阻斷MERS-CoV感染宿主細(xì)胞，但其中和能力有所差別，相對于強(qiáng)中和能力RBD單抗稍差，尤其是S2單抗只呈現(xiàn)出微弱的MERS-CoV中和能力；3株NTD中和單抗表位初步分析結(jié)果顯示其與變性rNTD蛋白結(jié)合

12、能力不同，推測其結(jié)合表位有所差別。
　　結(jié)論：
　　本研究篩選到34株針對MERS-CoV S蛋白和32株針對N蛋白的單抗，其中針對S蛋白單抗具有中和活性的抗原結(jié)合表位位于MERS-CoV的不同區(qū)域，包括S1亞基的RBD區(qū)域、NTD區(qū)域和 S2亞基區(qū)域；三株 NTD中和單抗結(jié)合抗原表位不同的初步分析結(jié)果提示MERS-CoV多種中和作用機(jī)制的存在的可能。同時成功篩選出一對基于MERS-CoV RBD單抗的配對組合，顯示了個位數(shù)