單抗的發(fā)展與應(yīng)用

1、© 2006 Accenture. All rights reserved.,1,Monoclonal antibody technology,© 2006 Accenture. All rights reserved.,2,輕鏈（L）由約214個amino acid組成，分兩種：Kappa（κ）和Lambda（λ），重鏈由450-550個amino acid組成，根據(jù)其抗原性差異可分為5種：μ鏈、γ鏈、α鏈、δ鏈和

2、ε鏈。由此將免疫球蛋白分為M、G、A、D和E。,© 2006 Accenture. All rights reserved.,3,1 抗體技術(shù)的發(fā)展,單克隆抗體技術(shù)的發(fā)展第1代單抗技術(shù)：鼠源性單克隆抗體第2代單抗技術(shù)：嵌合性單克隆抗體第3代單抗技術(shù)：人源化單克隆抗體第4代單抗技術(shù)：全人源化單克隆抗體,,© 2006 Accenture. All rights reserved.,4,1 細(xì)胞工程單克隆

3、抗體,,© 2006 Accenture. All rights reserved.,5,2 單鏈抗體（scFv）,SOE法構(gòu)建scFv基因產(chǎn)物,,,,,,,,,,,,,,,,VH,VL,VL,VH,變性、復(fù)性,接頭DNA，（Gly4Ser）3,引物,引物,,,接頭DNA,PCR,重疊延伸拼接法（SOE），是把Linker 的編碼序列分別設(shè)計在擴(kuò)增VH和VL引物中，用PCR直接合成scFv基因。 scFv的優(yōu)點

4、是分子量小、免疫原性弱、滲透力強，并具有藥物導(dǎo)向、中和毒素等功能，不需要進(jìn)行糖基化修飾，可以在原核表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)。缺點是無抗體C區(qū)，不能介導(dǎo)抗體的其他生物學(xué)活性。,,© 2006 Accenture. All rights reserved.,6,3 Fab抗體,Fab抗體分子的制備,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,Pr,VH,VH,VL,CL,CH1,CH1,VL,CL,S-S-,,H鏈表達(dá)載體,L鏈表達(dá)載體,

5、共轉(zhuǎn)染細(xì)胞,,,,,,,,,,抗體分泌細(xì)胞,Fab片段是由H鏈Fd段和完整L鏈通過二硫鍵形成的異二聚體，僅含有一個抗原結(jié)合位點，大小為完整抗體的1/3?？衫檬删w構(gòu)建表達(dá)有天然構(gòu)象的Fab片段。 Fab片段有中和毒素和病毒，封閉受體和藥物的螯合作用，其免疫原性低，但半衰期比完整抗體短的多。,Pr,,© 2006 Accenture. All rights reserved.,7,4 抗體庫技術(shù),抗體庫按基因的

6、來源可分為：鼠源性抗體庫，人源性抗體庫和駝源性抗體庫 抗體庫展示技術(shù)：噬菌體表面展示技術(shù)，酵母表面展示技術(shù)，核糖體展示技術(shù),抗體庫技術(shù)的優(yōu)點：1 不需要進(jìn)行細(xì)胞融合，避免了因雜交瘤不穩(wěn)定而需要反復(fù)亞克隆的繁瑣程序。2 擴(kuò)大了篩選容量，可達(dá)到106以上的克隆，而雜交瘤技術(shù)一般只能篩選約1000個克隆。3 可直接克隆到抗體的基因，便于進(jìn)一步構(gòu)建各種基因工程抗體。4 得到的抗體可以進(jìn)行原核表達(dá)，降低制備成本。5 構(gòu)建抗體庫時由于

7、H鏈和L鏈V區(qū)基因在體外隨機(jī)組合，因而可以獲得新的特異性抗體。已有的噬菌體抗體庫：抗HIV，麻疹病毒，破傷風(fēng)類毒素，呼吸道合抱病毒，乙肝病毒，單純皰疹病毒糖蛋白和TNF-α等的抗體庫。,© 2006 Accenture. All rights reserved.,8,構(gòu)建方法1 動物免疫2 血清效價檢測3 淋巴細(xì)胞的分離純化4 總RNA提取5 第一鏈cDNA反轉(zhuǎn)錄合成6 輕、重鏈基因的擴(kuò)增7 scFv DNA

8、的組裝與擴(kuò)增8 scFv DNA片段的Sfi I/Not I 酶切9 pCANTAB5E –scFv 重組質(zhì)粒的構(gòu)建10 重組噬菌體的制備11 庫容量的滴定12 單鏈抗體噬菌體抗體庫的富集淘選,4.1 噬菌體展示技術(shù)構(gòu)建和篩選scFv,圖片來源：蘇州康寧杰瑞生物科技有限公司,,© 2006 Accenture. All rights reserved.,9,4.2 噬菌體展示技術(shù)構(gòu)建和篩選Fab抗體,構(gòu)建方法淋巴細(xì)

9、胞分離、總RNA提取及cDNA的合成與scFv抗體庫的構(gòu)建相同1 PCR擴(kuò)增Fd及輕鏈基因2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的純化3 輕鏈基因的克隆4 重鏈Fd基因的克隆及噬菌體抗體庫的建立和鑒定5 Fd基因的克隆及抗體庫的建立6 抗體庫的富集和篩選,,© 2006 Accenture. All rights reserved.,10,4.3 酵母表面展示技術(shù),酵母表面展示技術(shù)是繼噬菌體展示技術(shù)之后發(fā)展起來的真核展示系統(tǒng)，不僅能

10、篩選噬菌體抗體庫的全部抗體，而且能篩選新型抗體，是噬菌體抗體庫篩選抗體的兩倍。 酵母存在MATa和MATα 2種交配型單倍體細(xì)胞。酵母表面展示技術(shù)有兩種：a凝集素展示系統(tǒng)是將目的蛋白的C端與a凝集素的Aga2亞基的N端融合；α凝集素展示系統(tǒng)是將目的蛋白的N端與α凝集素的C端融合。,α 凝激素展示系統(tǒng)原理圖,,© 2006 Accenture. All rights reserved.,11,5 特殊基因工程抗體,1.

11、7.1 雙特異性抗體BsAb,圖片來源：武漢友芝友生物制藥有限公司,利用基因重組和抗體工程技術(shù)，由大容量抗體庫的構(gòu)建及優(yōu)化系統(tǒng)，高通量抗體篩選系統(tǒng)，體內(nèi)體外抗體驗證系統(tǒng)三大部分組成，制備高效的腫瘤治療性抗體，對乳腺癌，淋巴瘤和結(jié)腸癌進(jìn)行針對性的治療。,細(xì)胞工程BsAb將2株分泌不同特異性單抗的雜交瘤細(xì)胞融合得到四源雜交瘤，就可以同時分泌具有兩種親代單克隆抗體結(jié)合特性的BsAb。其合成、組裝與分泌過程和天然免疫球蛋白的產(chǎn)生過程相同，穩(wěn)定

12、性及藥代動力學(xué)特征也與天然抗體相似。,,,© 2006 Accenture. All rights reserved.,12,6 人鼠嵌合單克隆抗體,為了消除人抗鼠抗體（HAMA）反應(yīng)，使單抗更好的用于疾病治療，人們設(shè)計了嵌合抗體。在基因水平上將鼠源單克隆抗體的V區(qū)和人抗體的C區(qū)連接起來，并在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)的抗體，成為人-鼠嵌合抗體。,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,Pr,鼠VL,人CL,人CH,,免疫球蛋白基

13、因載體的構(gòu)建,L鏈嵌合載體,共轉(zhuǎn)染細(xì)胞,,,,,,,,,,抗體分泌細(xì)胞,Pr,鼠VH,H鏈嵌合載體,,,,,,,,,嵌合抗體的構(gòu)建,已上市銷售的人鼠嵌合抗體：Rituximab CD20 抗腫瘤、類風(fēng)濕Cetuximab EGFR antagonist 抗腫瘤Clotinab,abciximab

14、 GPⅡb Ⅲa receptor 抗凝，心血管 antagonistInfliximab TNF-α antagonist 類風(fēng)濕，克隆氏病等Basiliximab IL-2 receptor antagonist 抗移植排斥,,,,,,© 2006 Accenture

15、. All rights reserved.,13,全人源化單抗 人源化技術(shù)的難點在于它需要大量的學(xué)科集成，非常復(fù)雜，因為任何氨基酸改變都會影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、活性，而這方面又沒有太多規(guī)范可以遵循，因此需要大量的實踐和探索。這是單抗藥物研發(fā)的核心技術(shù) ，也是未來的發(fā)展方向。兩個難點：一是抗體人源化技術(shù)，二是哺乳動物細(xì)胞規(guī)?；囵B(yǎng)。 已上市的人源單抗：Panitumumab EGFR antagonist

16、 直腸癌Adalimumab TNF antagonist 類風(fēng)濕，克隆氏病等Ustekinumab IL-12,IL-23 antagonist 銀屑病,7 全人源化單克隆抗體,全人源化單抗的兩條技術(shù)路線：轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)，噬菌體展示技術(shù),,© 2006 Accenture. All rights reserved.,14,轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)

17、 目前主要是人外周血淋巴細(xì)胞-嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷（hu-PBL-SCID）轉(zhuǎn)基因小鼠和轉(zhuǎn)染色體小鼠制備人抗體技術(shù)。,hu-PBL-SCID轉(zhuǎn)基因小鼠將已產(chǎn)生一定免疫反應(yīng)的供者或癌癥患者的淋巴細(xì)胞導(dǎo)入嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷（severe combined immunodeficiency，SCID）小鼠，作為暫時的人免疫系統(tǒng)發(fā)揮有限的功能。然后取鼠的脾細(xì)胞與人骨髓瘤細(xì)胞雜交就可以獲得分泌人抗體的雜交瘤細(xì)胞,轉(zhuǎn)染色體小鼠通過基因敲出技術(shù)使小鼠

18、自身基因失活并導(dǎo)入新基因，創(chuàng)造出攜帶人抗體H、L鏈基因簇而自身抗體基因失活的轉(zhuǎn)基因小鼠。此種小鼠所攜帶的人DNA片段具有完備的功能，可以有效的進(jìn)行同種型轉(zhuǎn)換和親和力成熟。,,,親和力成熟：在抗原刺激下，抗體V區(qū)發(fā)生高頻突變，具有高親和力抗體的細(xì)胞群體獲得優(yōu)勢而進(jìn)一步擴(kuò)增，同時經(jīng)過類別轉(zhuǎn)換，即不再表達(dá)μ鏈、 δ鏈，而表達(dá)γ、α或ε而成熟。,© 2006 Accenture. All rights reserved.,15,2 抗

19、體的市場和應(yīng)用,單抗從最初的鼠源單抗過渡至人源化單抗直到現(xiàn)在的全人單抗,單克隆抗體的發(fā)展使抗體制備技術(shù)進(jìn)入了一個全新的時代, 其相關(guān)的藥物已廣泛應(yīng)用到生物醫(yī)學(xué)中的許多領(lǐng)域, 如腫瘤、自身免疫性疾病、器官移植、戒毒、血液性疾病、感染性疾病、中毒性疾病、變態(tài)反應(yīng)性疾病等方面的診斷和治療。 目前美國和歐盟已批準(zhǔn)上市抗體藥物34個，全球有近300家公司正在研究抗體藥物，其中，臨床研究抗體項目有100多個，在研項目超過300個。我國已批

20、準(zhǔn)上市抗體藥物18種，其中進(jìn)口10種，國內(nèi)企業(yè)獲得抗體新藥證書8個，實現(xiàn)銷售4種，臨床研究抗體藥物13種。 （截止到2012.12）,2011年全球抗體藥物的市場規(guī)模為671億美元。預(yù)計到2020年,生物技術(shù)藥物占全部藥品銷售收入的比重將超過1/3。 據(jù)全球醫(yī)藥市場預(yù)測機(jī)構(gòu)EvaluatePharma對2012年銷售前15位藥品的估計,今年生物技術(shù)產(chǎn)品全面崛起,其中銷售前十強中,單克隆抗體藥物占據(jù)五席。,,,©

21、2006 Accenture. All rights reserved.,16,國內(nèi)主要抗體公司成都華神集團(tuán)股份有限公司制藥廠華蘭生物工程股份有限公司上海蘭生股份有限公司北京天壇生物制品股份有限公司上海中信國建藥業(yè)股份有限公司百泰生物藥業(yè)有限公司北京天廣實生物技術(shù)有限公司大連亞維藥業(yè)有限公司美恩生物技術(shù)有限公司武漢生物制品研究所上海張江生物技術(shù)有限公司上海亞聯(lián)抗體醫(yī)藥有限公司,國外主要抗體藥物公司瑞士羅氏公司