雞血清IgG的純化及其單抗制備與鑒定.pdf

1、IgG是血清中主要的免疫球蛋白(Ig)，占血清Ig總量的75％～80％，它是血液中主要的抗體成分，血清中IgG水平的測定，已是疫苗免疫效果評定和體液免疫研究的常用指標(biāo)。與常規(guī)免疫血清相比，單克隆抗體具有與抗原結(jié)合的高特異性，是免疫學(xué)和血清學(xué)研究的重要工具，在畜牧獸醫(yī)的疾病診斷與治療方面已經(jīng)被廣泛應(yīng)用。在養(yǎng)禽業(yè)中，運用這些單克隆抗體來檢測疫病特異性的抗體，對全面、系統(tǒng)地了解禽的機體對病原體感染的免疫應(yīng)答反應(yīng)并采取相應(yīng)的防制措施有重要意義。

2、此外，為研制有效試劑盒，檢測禽病及疫苗免疫水平奠定基礎(chǔ)。
　　 本文主要圍繞雞免疫球蛋白的提純及其單抗制備與鑒定，做了如下工作：
　　 首先，采用飽和硫酸銨鹽析粗提雞血清Ig，然后再用葡聚糖G200凝膠層析分離純化IgG。經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳進行純度鑒定，表明純化后的IgG達到了一定純度。同時，用Folin-酚法進行濃度測定，IgG蛋白濃度達到2.4mg/mL。
　　 其次，用純化后的雞IgG按常規(guī)方法免疫

3、6～8周Balb/c雌性小鼠，無菌取三次免疫后的小鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞進行細胞融合，采用間接ELISA法篩選陽性雜交瘤細胞，連續(xù)進行兩次亞克隆，共獲得了四株分泌抗雞IgG單克隆抗體的雜交瘤細胞株，分別命名為C44、C45、C67、C68。經(jīng)過五次亞克隆，四株單克隆雜交瘤細胞能夠穩(wěn)定分泌抗IgG抗體。
　　 最后，對這四株單克隆抗體從效價、Ig亞類、特異性以及反應(yīng)交叉性這些免疫特性方面進行鑒定，通過間接ELISA試驗測定

4、，C44、C45、C67、C68四株單克隆雜交瘤細胞株細胞培養(yǎng)上清和小鼠腹水抗體滴度分別為1：400、1：1600、1：3200、1：400和1:640000、1:320000、1：640000、1：80000;小鼠單抗Ig類/亞類鑒定用酶標(biāo)二抗即用試劑盒來測定得出四株單克隆抗體的重鏈均為IgG1型；運用Western Blot方法分析四株單克隆抗體的特異性，表明：C44株、C45株單抗是抗雞IgG輕鏈，C67株、C68株單抗與雞血清中

5、IgG重鏈發(fā)生特異性結(jié)合，為抗雞IgG重鏈的單抗；以間接ELISA測定四株單克隆抗體與豬、兔和鴨等動物血清的交叉反應(yīng)性，結(jié)果顯示單克隆抗體C44、C45、C67、C68僅特異識別雞IgG，未見與其他動物血清發(fā)生交叉反應(yīng)，并進行Western blot驗證，表明C44株、C45株單抗與雞血清中IgG的輕鏈發(fā)生特異性反應(yīng)，與鴨、兔、豬血清均沒有發(fā)生特異性反應(yīng)，C67株、C68株單抗均抗雞血清中IgG重鏈，與鴨、兔、豬血清均不發(fā)生特異性結(jié)合。