磺胺甲噁唑單抗的制備及初步應(yīng)用.pdf

1、磺胺甲噁唑(Sulfamethoxazole，SMZ)，在獸醫(yī)臨床上主要用于呼吸道和泌尿道感染。其與抗菌增效劑甲氧芐氨嘧啶(TMP)聯(lián)合應(yīng)用藥物復(fù)方新諾明，具有抗菌譜廣、療效確切、性質(zhì)穩(wěn)定、使用方便、價(jià)格低廉、國(guó)內(nèi)能大量生產(chǎn)等諸多優(yōu)點(diǎn)，使得它成為目前獸醫(yī)臨床上磺胺類(lèi)藥物(Sulfonamides，SAs)中應(yīng)用最廣泛的抗菌藥物之一。與此同時(shí)，濫用、濫添加于動(dòng)物和動(dòng)物飼料中的事件屢見(jiàn)不鮮，最終導(dǎo)致其在動(dòng)物性產(chǎn)品中殘留過(guò)高，這不僅對(duì)動(dòng)物本身

2、有很大的毒副作用，也對(duì)人類(lèi)健康產(chǎn)生極大的損害!許多國(guó)家和組織規(guī)定了磺胺類(lèi)藥物的最高殘留限量(Maximum Residues Limits，MRL)，韓國(guó)、美國(guó)、歐共體(EEC)、以及在國(guó)際食品法典委員會(huì)(CAC)下設(shè)立的食品中獸藥殘留法典委員會(huì)(CCRVDF)等都規(guī)定了磺胺類(lèi)總量和或具體單個(gè)磺胺類(lèi)藥物的含量不得超過(guò)0.1mg/kg，日本更是對(duì)個(gè)別磺胺類(lèi)藥物規(guī)定不得檢出。因此，開(kāi)發(fā)和建立高效、準(zhǔn)確、低廉的磺胺類(lèi)藥檢測(cè)方法具有極其重要的現(xiàn)

3、實(shí)意義。 目前，關(guān)于磺胺類(lèi)藥物的檢測(cè)方法主要有傳統(tǒng)方法，包括微生物學(xué)測(cè)定法、滴定法、分光光度法等；色譜技術(shù)，包括氣相色譜(GC)、高效液相色譜(HPLC)、氣/液-質(zhì)聯(lián)用(GC/LC-MS)、毛細(xì)管電泳法(CE)、超臨界流體色譜技術(shù)(SFC)等；免疫學(xué)分析法，包括酶聯(lián)免疫吸附法(EIASA)、熒光免疫測(cè)定法(FLA)、膠體金免疫測(cè)定法(CGIA)、免疫傳感器(IB)等。傳統(tǒng)方法靈敏度不高，特異性不強(qiáng)，易被其它物質(zhì)干擾，且分析時(shí)間

4、較長(zhǎng)；色譜技術(shù)雖然靈敏度高，但檢測(cè)儀器化程度高，設(shè)備昂貴，操作技術(shù)要求高，前處理要求高；免疫學(xué)方法特異性強(qiáng)、靈敏度高、前處理簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便、易推廣使用，其中酶聯(lián)免疫吸附法同時(shí)可檢測(cè)多個(gè)樣品，特異性強(qiáng)、靈敏度高、速度快，是一個(gè)準(zhǔn)確性、安全性高、實(shí)用性強(qiáng)的檢測(cè)技術(shù)。 本研究運(yùn)用化學(xué)合成方法制備SMZ完全抗原，采用單克隆抗體技術(shù)制備靈敏度高、特異性強(qiáng)、效價(jià)高的單抗，建立了ELISA測(cè)定方法，并初步應(yīng)用于豬肉、雞蛋、蜂蜜和牛奶中SMZ藥

5、物的檢測(cè)。 由于磺胺甲噁唑分子量很小，僅為253.28，為半抗原。本研究利用磺胺甲噁唑具有的伯氨基結(jié)構(gòu)，通過(guò)重氮法將其與載體蛋白HSA和BSA偶聯(lián)，制備的兩種人工抗原偶聯(lián)比分別為：23:l和21:1。用SMZ-BSA免疫7周齡BALB/c雌性小鼠后，融合前血清效價(jià)已達(dá)1:400,000以上。利用單克隆抗體技術(shù)和現(xiàn)代細(xì)胞融合技術(shù)，經(jīng)過(guò)篩選，獲得兩株單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株3G11和2H10，穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明，這兩株單抗細(xì)胞株可穩(wěn)定地分

6、泌抗SMZ單克隆抗體。 通過(guò)建立間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，測(cè)定腹水最佳工作濃度在1:1×106以上。用3G11制備的腹水作出的SMZ藥物抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，其線(xiàn)性方程為：y=0.206x-0.0317(R2=0.9885)，LOD為3.29ng/ml，LOQ為23.06ng/ml。通過(guò)對(duì)同類(lèi)藥物以及兩種非磺胺類(lèi)藥物的交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn)表明該SMZ單抗的特異性良好，對(duì)其他藥物的抑制率均小于10％。 另外，本研究對(duì)應(yīng)用磺胺甲嗯唑較多的動(dòng)物

7、性食品進(jìn)行了添加回收試驗(yàn)。對(duì)樣品處理方法進(jìn)行了優(yōu)化。測(cè)得在牛奶中藥物添加回收率為98.9％～129.1％，在蛋黃、蛋清以及全蛋中的添加回收率分別為78.7％～102.3％、71.9％～85.3％和78.7％～102.3％，在豬肉中的添加回收率為89.7％～116.2％，在蜂蜜中的添加回收率為74％～111.7％。試驗(yàn)表明本實(shí)驗(yàn)所制備的磺胺甲噁唑單克隆抗體可用于對(duì)于動(dòng)物性食品中磺胺甲噁唑殘留的檢測(cè)，為磺胺甲噁唑殘留酶聯(lián)免疫快速檢測(cè)試劑盒或