消脂方對腸道菌群結(jié)構(gòu)與抗非酒精性脂肪性肝炎作用的相關(guān)性及機制研究.pdf

1、目的:
　　研究消脂湯對非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型治療作用及對腸道菌群的影響，探討相關(guān)作用機制，體外實驗進一步探討消脂湯對游離脂肪酸(FFAs)誘導(dǎo)的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)細胞模型的作用及機制。
　　方法:
　　實驗小鼠（C57BL/6j小鼠）采用區(qū)組隨機法隨機分為正常組、正消組及模型組，正常及正消組小鼠喂食正常飼料，模型組喂食D12482高脂飼料，D12492高脂飼料誘導(dǎo)建立非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型，模型成

2、功后，模型組隨機分為模型組、消脂湯高、中、低劑量組及非諾貝特組，分別給予相應(yīng)不同劑量的藥物灌胃，治療9周，其中第3、6、9周分別留取小鼠糞便提取總DNA，最后1周治療結(jié)束后，進食12h，采血，離心，檢測血清腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素6（IL-6）、內(nèi)毒素(LPS)及相關(guān)生化指標(biāo)，取肝臟行病理HE染色和油紅O染色;熒光定量PCR(RT—PCR)檢測結(jié)腸內(nèi)容物中普雷沃氏菌屬、梭桿菌屬、雙歧桿菌、乳酸桿菌、大腸埃希菌等主要腸道菌群數(shù)

3、量的變化;提取糞便及結(jié)腸內(nèi)容物總DNA，采用高通量測序技術(shù)檢測NASH小鼠糞便和腸粘膜組織中的微生物結(jié)構(gòu)及多樣性的變化;RT-PCR檢測TLR4及NF-κBp65 mRNA的表達情況，免疫組織化學(xué)染色法檢測TLR4及NF-κB p65蛋白表達情況;體外實驗:用0.5μmol/L FFA誘導(dǎo)HepG2細胞建立NASH細胞模型，用不同濃度的消脂湯及非諾貝特干預(yù)NASH細胞模型;油紅O染色觀察細胞內(nèi)脂滴含量;Elisa檢測細胞上清液中TNF-

4、α、IL-6的含量;Western blotting檢測NF-κB p65、 IKKβ、Phospho-IKKα/β(Ser176/180)、Phospho-IRS-1(Ser307)、IRS-1蛋白表達。
　　結(jié)果:
　　與正常組相比，模型組血清甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、空腹血糖(FBG)，空腹胰島素(FINS)、胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)，LP

5、S，TNF-α，IL-6水平顯著升高(P＜0.05或P＜0.01);各治療組與模型組相比，治療組FBG，F(xiàn)INS，HOMA-IR、TC、TG顯著降低(P＜0.01)，但非諾貝特組血清ALT、AST無明顯降低。模型組較正常組相比，模型組內(nèi)小鼠肝組織TLR4、NF-κ B mRNA相對表達量明顯升高(P＜0.05，P＜0.01)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義;與模型組相比，消脂湯高劑量組小鼠肝組織TLR4、NF-κB mRNA相對表達量明顯減少（P＜0

6、.05，P＜0.01），消脂湯中、低劑量組小鼠肝組織TLR4mRNA相對表達量較模型組顯著減少（P＜0.01），但中、低劑量組NF-κB mRNA相對表達量較模型組相比無顯著差異。與正常組相比，模型組TLR4、NF-κB mean density數(shù)值明顯較高（P＜0.05，P＜0.01），差異有統(tǒng)計學(xué)意義;與模型組相比，消脂湯高劑量組TLR4、NF-κB mean density數(shù)值較小（P＜0.05，P＜0.01），表明消脂湯高劑量組

7、TLR4、NF-κB蛋白表達減少;模型組小鼠結(jié)腸內(nèi)梭桿菌屬、普雷沃氏菌屬、雙歧桿菌及乳酸桿菌數(shù)量相較于模型組明顯減少（P＜0.01），而大腸埃希菌數(shù)量升高（P＜0.01），而正常組與正消組相比無明顯差異;消脂湯高、中劑量組與模型組比較，梭桿菌屬、普雷沃氏菌屬、雙歧桿菌及乳酸桿菌數(shù)量明顯升高(P＜0.05)，大腸埃希菌數(shù)量減少（P＜0.01），而消脂湯低劑量組、非諾貝特組與模型組無差異。體外實驗:FFA刺激24h后，模型組內(nèi)脂滴含量、細胞

8、上清液中TNF-α、IL-6的含量明顯高于正常組（P＜0.01），IKKβ、P-IKKα/β(Ser176/180)、P-IRS-1(Ser307)、NF-κBp65核蛋白表達明顯增加（P＜0.01），IRS-1蛋白表達減少（P＜0.05），而各給藥組P-IKKα/β(Ser176/180)、P-IRS-1(Ser307)蛋白表達減少（P＜0.01），尤其是消脂湯高劑量組較消脂湯中、低劑量組及非諾貝特P-IKKα/β(Ser176/18

9、0)、P-IRS-1(Ser307)蛋白表達顯著減少（P＜0.01），各給藥組IRS-1蛋白表達明顯增加(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　消脂湯能顯著緩解NASH病情，改善胰島素抵抗，使肝臟脂肪蓄積減少，減輕肝臟炎癥反應(yīng)，可能與其調(diào)整腸道菌群，促進乳酸桿菌、雙歧桿菌等優(yōu)勢菌群數(shù)量的增長相關(guān)，調(diào)整腸道菌群結(jié)構(gòu)相關(guān)。消脂湯可改善FFA誘導(dǎo)的NASH細胞模型中脂質(zhì)沉積及炎癥反應(yīng)，其機制可能與抑制細胞內(nèi)IKKα/β、IRS-1Se