布拉氏酵母菌對實驗性大鼠非酒精性脂肪性肝炎的療效及其作用機制的研究.pdf

1、非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholicfattyliverdisease，NAFLD)是指除乙醇和其他明確的肝損傷因素外，以彌漫性肝大泡性脂肪變、伴或不伴炎癥為主要特征的臨床病理綜合征，包括單純性脂肪肝、脂肪性肝炎、肝纖維化以及肝硬化。非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholicsteatohepatitis，NASH)是單純性脂肪肝發(fā)展成為肝纖維化及肝硬化的必經途徑。
　　 近年隨著研究的不斷深入.由小腸細菌過度生長

2、(smallintestinalbacterialovergrowth，SIBO)、細菌易位、腸黏膜通透性改變等所致的腸源性內毒素血癥(intestinalendotoxemia，IETM)在NASH病程中起到了關鍵作用。內毒素是革蘭氏陰性桿菌細胞壁外層的主要成分，也稱脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，是肝損傷中的一個重要因子，主要與釋放的炎性細胞因子和介質有關，它能激發(fā)機體引起強烈的炎癥反應，促進單純性脂肪肝向非

3、酒精性脂肪性肝炎進展。宿主細胞膜上的模式識別受體是介導細胞識別LPS，并啟動LPS反應的首要環(huán)節(jié)。LPS與白細胞分化抗原14（Clusterofdifferentiation14，CD14）和Toll樣受體4(Toll-likereceptor4，TLR4)相互作用產生跨膜信號引起LPS介導的細胞激活，從而通過LPS-CD14-TLR4信號通路誘導炎癥細胞因子包括TNF-α、IL-1、IL-6、NO等的大量表達，進而損傷肝臟。
　

4、　 布拉氏酵母菌是一類益生菌，可以維持腸道微生物的平衡，抑制腸源性內毒素的產生，促進體內內毒素向腸腔轉移，加速內毒素的排泄，減少內毒素對肝臟的刺激，使CD14、TLR4表達減低，最終減少促炎性細胞因子的分泌和釋放，起到保護肝臟的作用。因此，我們擬通過研究布拉氏酵母菌干預下非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝組織CD14、TLR4表達的變化，進一步探討益生菌在治療非酒精性脂肪性肝病中的機制，從而以利于臨床合理開展非酒精性脂肪性肝病治療和防治工作。<

5、br>　　 目的:高脂飲食構建非酒精性脂肪性肝炎大鼠模型，測定血清內毒素的水平，以及該過程中布拉氏酵母菌對大鼠肝組織CD14、TLR4表達的影響，探討布拉氏酵母菌對實驗性大鼠非酒精性脂肪性肝炎的療效及其可能的作用機制。
　　 方法:42只雄性SD大鼠，體重180±20g，適應性喂養(yǎng)1周后隨機分為如下3組:①Control組14只，給予基礎飼料喂養(yǎng);②Model組14只，給予高脂飼料喂養(yǎng)（88％普通飼料+2％膽固醇+10％豬油）

6、;③Treatment組14只，給予高脂飼料喂養(yǎng)。實驗動物均分籠（每籠4只）飼養(yǎng)于25±2℃、明暗各12h的動物實驗室內，自由飲水進食。于喂飼16周末各組隨機處死4只，行肝組織HE染色確定非酒精性脂肪性肝炎大鼠模型成功。自17周開始治療組給予布拉氏酵母菌散劑（78*108CFU/kg·d-1）灌胃，正常對照組及模型組給予等容量蒸餾水灌胃。每周記錄動物體重1次，根據體重變化調節(jié)灌胃計量，連續(xù)進行至24周末給藥期結束，處死全部大鼠。

7、　　 觀察肝臟的大體情況，并完整切除肝臟，稱肝臟濕重;采用全自動生化分析儀測定血清谷丙轉氨酶，谷草轉氨酶和甘油三酯;采用鱟試劑法測定血清內毒素水平;采用HE染色觀察肝臟病理變化;采用免疫組織化學方法觀察肝組織CD14、TLR4蛋白的表達情況;采用熒光定量PCR(realtimefluores-cencequantitativePCR，RTFQPCR)方法測定肝組織CD14mRNA、TLR4mRNA的水平。
　　 結果:①喂飼1

8、6周末時，對部分大鼠肝組織行HE染色:高脂飲食的大鼠出現肝臟脂肪變、氣球樣變及炎癥細胞浸潤，明確證實給予高脂飲食成功復制了NASH大鼠模型。②大鼠體重、肝濕重及肝指數(肝濕重/體重×100％):24周末時稱重，模型組大鼠的體重（567.60±18.89）、肝重（19.68±2.68）、肝指數（3.47±0.43）均明顯高于正常對照組的體重(460.71±14.71)、肝重（11.53±0.98）及肝指數（2.5±0.12）(P＜0.05

9、)。與模型組相比，治療組體重（521.50±19.40）、肝重(15.06±1.32)及肝指數(2.89±0.20)均明顯降低(P＜0.05)。③血清生化指標:模型組ALT(103.44±8.41)較正常對照組(39.10±9.37)顯著增高(P＜0.05)，與模型組相比，治療組ALT(71.03±7.98)明顯降低(P＜0.05);模型組AST(276.95±25.06)，較正常對照組(145.37±15.19)顯著增高(P＜0.05

10、)，與模型組相比，治療組AST(191.68±14.62)明顯降低(P＜0.05）;模型組TG(0.93±0.14)較正常對照組(0.54±0.10)顯著升高(P＜0.05)，治療組TG(0.73±0.11)較模型組明顯下降(P＜0.05);④模型組血清內毒素水平（0.3600±0.0293）顯著高于正常對照組（0.12±0.05）(P＜0.05），與模型組相比，治療組血清內毒素水平（0.2226±0.0156）明顯降低(P＜0.05)

11、。⑤肝臟病理學改變:16周末大鼠肝組織HE染色顯示，正常對照組大鼠肝細胞內均無脂肪變性及氣球樣變，部分大鼠肝組織內可見少量炎性細胞浸潤;給予高脂飲食的模型組大鼠肝組織均可見大泡性和小泡性混合型脂肪空泡，彌漫性的肝細胞脂肪變性，部分氣球樣變肝細胞周圍伴有明顯炎性細胞浸潤。隨著造模時間的逐漸延長，模型組大鼠肝臟脂肪變程度越來越明顯，24周末脂肪變程度較前明顯加重，以重度為主，肝細胞胞漿內充滿大量脂肪空泡，還可見到程度不等的小葉內炎癥，匯管區(qū)

12、炎癥及點灶狀壞死，NAS炎癥評分與正常組相比有顯著性差異(P＜0.05)。與模型組相比，治療組NAS炎癥評分較模型組明顯改善（P＜0.05）。⑥免疫組化顯示，正常對照組肝組織低表達CD14(0.0735±0.0134)、TLR4(0.0764±0.0189);模型組肝組織CD14（0.2118±0.0399）、TLR4表達(0.2151±0.0167)較對照組顯著增強(P＜0.05）;治療組CD14（0.1435±0.0604）、TLR

13、4（0.1538±0.0257）較模型組明顯減低(P＜0.05）。⑦應用熒光定量PCR技術分析，正常對照組肝組織低表達CD14mRNA（0.4529±0.2439）、TLR4mRNA(0.9049.±0.1135);模型組肝組織CD14mRNA（1.5315±0.2527）、TLR4mRNA(2.4198±0.2289)較正常對照組顯著增強(P＜0.05）;治療組CD14mRNA（0.9967±0.2981）、TLR4mRNA（1.69