一對同卵雙生個體DNA甲基化譜差異的研究.pdf

1、目的:DNA甲基化是指在基因組DNA中胞嘧啶第5位碳原子發(fā)生甲基共價修飾,其主要發(fā)生在CpG二核苷酸。作為表觀遺傳學的重要研究內(nèi)容之一,它在調節(jié)細胞的分化增殖、人體生命活動中發(fā)揮著重要作用。同卵雙生子(monozygotic twins,MZ)是由一個受精卵在內(nèi)在和外在因素的共同作用下,發(fā)育為兩個完全獨立的個體,因此同卵雙生兩個體的遺傳背景完全相同,享有共同的DNA序列。在法醫(yī)DNA分析領域,現(xiàn)有的DNA遺傳分析系統(tǒng)理論上可以識別除同卵

2、雙生子外的所有個體。然而,對于遺傳DNA序列完全相同的同卵雙生個體,現(xiàn)有的DNA分析手段尚不能有效鑒別。目前,眾多對于同卵雙生子表觀遺傳學的研究都己證實,同卵雙生子無論在整個表觀遺傳組水平還是對于特異位點都存在著表觀遺傳的差異,而且每一個體的表觀遺傳水平在生命的每個階段也是呈現(xiàn)一種動態(tài)變化過程。本研究采用甲基化免疫共沉淀結合高通量測序的方法(methylatedDNA immunoprecipitation sequencing,MeD

3、IP-seq),探索在新生兒同卵雙生子的DNA甲基化譜分布特點及其之間的差異,并且尋找到若干普遍存在的差異位點,為在表觀遺傳水平建立同卵雙生子識別系統(tǒng)提供基礎。
　　 方法:收集5對雙胞胎新生兒臍帶血,應用DP-318血液基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)提取血液基因組DNA,用Identifiler(R)試劑盒檢測15個常染色體STR基因座分型,選擇分型完全相同的1對同卵雙生子DNA樣本,應用MeDIP-seq方法

4、進行甲基化譜分析。首先用超聲將DNA隨機打斷至100～500bp,進行DNA末端修復,3’末端加上“A”堿基及測序接頭;然后將雙鏈DNA變性為單鏈,用5-Mc抗體沉淀,MeDIP沉淀產(chǎn)物進行Qpcr驗證,隨后進行純化及擴增,選擇200-300bp的片段進行TA克隆、SOLEXA測序。將測序結果與參考基因組比對,可唯一比對的序列用于后續(xù)的信息分析,包括reads統(tǒng)計與分布,MeDIP-seq序列富集區(qū)域(peak)的信息分析,peak水平

5、的差異分析,peak區(qū)域基因本體(geneontology,GO)分析。根據(jù)分析結果,從中選擇適合于法醫(yī)DNA分析的DNA甲基化差異位點,作為后續(xù)研究的候選位點。
　　 結果:
　　 1基本生物信息分析:對于此對同卵雙胞胎的MeDIP測序,各獲得3.6G數(shù)據(jù),包含有73,469,388條reads,每條reads讀長為49bp。將這些reads與參考基因組比對,兩樣本分別獲得65,207,711條和65,579,985條

6、reads,分別占總reads的88.75％和89.26％,其中可唯一比對的reads分別為48,754,692和50,069,020條,分別占可比對數(shù)目的74.77％和76.35％?；蚪M覆蓋率分別為33.25％和38.76％,覆蓋深度分別為3.22和2.76。統(tǒng)計可唯一比對reads在基因各功能元件分布,發(fā)現(xiàn)在各功能元件均有分布但分布不均,以重復區(qū)域分布最多。統(tǒng)計在各重復區(qū)域的分布,發(fā)現(xiàn)在多個重復區(qū)域均有分布,然而在短散在重復序列/

7、Alu序列分布最多。
　　 2 MeDIP-seq序列富集區(qū)域(Peak)信息分析:統(tǒng)計可唯一比對reads的富集區(qū)域(peak),各得到257,362條和197,272條peak,基因組覆蓋率達到6.53％和5.29％。統(tǒng)計這些peak在各長度區(qū)間的分布,發(fā)現(xiàn)兩樣本均在600～700bp長度區(qū)間擁有最多的peak,并且雖然在各長度區(qū)間分布趨勢相似,然而數(shù)目卻有所不同。統(tǒng)計peak在各基因功能元件分布,發(fā)現(xiàn)peak在各基因功能元

8、件的統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)兩樣本在各元件均有分布,但均以internalintrons分布最多。對這些peak相關基因進行GO功能注釋分析,發(fā)現(xiàn)在GO的三項功能條目中均有分布但分布不均。
　　 3 DNA甲基化差異序列分析:在基因相關區(qū)域統(tǒng)計兩樣本間差異基因功能元件,共得到477個差異基因功能元件。對這些尋找到的基因功能元件進行GO功能富集發(fā)現(xiàn)這些差異基因在GO的三個分支中均有分布,只是分布水平不同。在全基因組范圍內(nèi)尋找具有顯著差異的區(qū)域,共

9、找到2205條存在DNA甲基化差異的序列,其中595條位于基因區(qū)域,1610條位于基因間區(qū)。從這些差異片段中,我們最終選出113個片段作為后續(xù)分析的候選位占
　　 結論:
　　 1本研究首次應用MeDIP-seq的方法檢測一對新生兒同卵雙生個體DNA甲基化譜系特征,并進行差異位點的篩選,找到2205條存在DNA甲基化差異的序列,其中595條位于基因區(qū)域,1610條位于基因間區(qū)。
　　 2初步證實了DNA甲基化鑒別