甄別同卵雙生子的DNA甲基化序列篩選研究.pdf

1、目的：同卵雙生子（MZT）由一個(gè)受精卵分裂形成，DNA序列高度相似，傳統(tǒng)的法醫(yī)學(xué)遺傳標(biāo)記如短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）、單核苷酸多態(tài)性（SNP）等難以將二者區(qū)分，是為MZT涉嫌犯罪案件中生物檢材身份認(rèn)定的一大難題。大量研究表明MZT之間存在表觀遺傳學(xué)差異。前期研究應(yīng)用甲基化免疫共沉淀測序技術(shù)（MeDIP），對(duì)5對(duì)表型一致的MZT進(jìn)行全基因組甲基化檢測分析，從中篩選一些差異甲基化序列，有些分布在CpG島（GI），有些序列為非 CpG島序列（n

2、on-CGI）。本研究從中選取若干 CGI序列和non-CGI序列進(jìn)行大樣本研究，以驗(yàn)證這些序列區(qū)分MZT的效果和能力，為解決甄別MZT個(gè)體難題提供科學(xué)依據(jù)。
　　方法：從本課題組建立的雙生子樣本庫中選取100對(duì)MZT樣本，應(yīng)用 Qiagen公司的QIAamp DNA Blood kit提取血液樣本的DNA。應(yīng)用ZYMO公司的EZ DNA Methylation-Gold Kit對(duì)基因組DNA進(jìn)行重亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化，以轉(zhuǎn)化后的DNA

3、為模板，擴(kuò)增四個(gè)位于CGI的序列（CGIS）及四個(gè)位于non-CGI的序列。四個(gè)CGI序列分別位于2號(hào)染色體的基因間區(qū)、人類白細(xì)胞抗原B伴隨轉(zhuǎn)錄物3（BAT3）基因啟動(dòng)子區(qū)、氨氯吡嗪脒敏感陽離子通道1（ACCN1）基因啟動(dòng)子區(qū)、G蛋白信號(hào)調(diào)節(jié)子16（RGS16）基因啟動(dòng)子區(qū)，分別命名為CGIS1、 CGIS2、CGIS3、CGIS4。四個(gè)non-CGI序列均位于基因間區(qū)（IGS），分別命名為 IGS3、 IGS4、IGS5、IGS6，其

4、染色體定位分別為：chr1:114870877-114871203、chr12:67213759-67214092、chr11:5539842-5540207、chr1:56877427-56877787。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行單鏈純化后行焦磷酸測序，獲得八條靶序列共40個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化水平的定量數(shù)據(jù)。每個(gè)樣本重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)。應(yīng)用Excel、Spearman相關(guān)檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)、方差分析、秩和檢驗(yàn)等方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果：
　　

5、1.八條靶序列的平均DNA甲基化水平
　　1.1四個(gè)CGI序列的平均甲基化水平。在所調(diào)查的152個(gè)血液樣本中，CGIS1、CGIS2、CGIS3、CGIS4序列的平均甲基化水平分別為：21.37％、0.41%、5.05%、1.56%。
　　1.2四個(gè)non-CGI序列的平均甲基化水平。在所調(diào)查的200個(gè)血液樣本中，IGS3、IGS4、IGS5、IGS6序列的平均甲基化水平分別為88.18%、87.07%、77.45%、87.

6、87%。
　　2.雙生子之間甲基化差異分析。參照焦磷酸測序儀用戶手冊，焦磷酸測序儀靈敏度為5%，在實(shí)驗(yàn)中，如甲基化水平差值在雙生子之間大于5%，則認(rèn)為兩者之間存在差異，反之則認(rèn)為無差異。
　　2.1各序列雙生子間差異分析。在所檢測的76對(duì)MZT中，CGIS1序列在MZT之間甲基化水平有差異的有6對(duì)，占MZT樣本量的7.89%，表明CGIS1序列4個(gè)CpG位點(diǎn)區(qū)分MZT的鑒別能力為7.89%；在所檢測的100對(duì)MZT中，IGS

7、3、IGS4、IGS5、IGS6序列在MZT之間甲基化水平有差異的分別有37對(duì)、7對(duì)、48對(duì)、44對(duì)，四個(gè)non-CGI序列累積能夠區(qū)分81對(duì)MZT，占MZT樣本量的81.00%，表明四個(gè)non-CGI序列16個(gè)CpG位點(diǎn)區(qū)分MZT的累積鑒別能力為81.00%。對(duì)CGIS1序列和四個(gè)non-CGI序列區(qū)分MZT的能力進(jìn)行2檢驗(yàn)比較分析，發(fā)現(xiàn)和non-CGI序列區(qū)分MZT的能力高于CGIS1序列區(qū)分MZT的能力。
　　2.2雙生子之

8、間甲基化差異與年齡的相關(guān)性分析。探討雙生子間甲基化的差異與年齡的相關(guān)性，結(jié)果表明，在MZT之間，IGS6序列的DNA甲基化差異與年齡呈較弱的負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.304，也就是，隨著年齡增大，MZT之間的甲基化差異逐漸減小。其余序列甲基化水平在MZT之間的差異與年齡均無明顯相關(guān)性。
　　3.甲基化與年齡、性別、民族、吸煙的相關(guān)性
　　3.1年齡對(duì)四個(gè)non-CGI序列甲基化的影響。Spearman秩相關(guān)分析結(jié)果表明， IG

9、S3、IGS4兩條靶序列的甲基化程度均與年齡呈弱相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.161、-0.384。其余兩條序列甲基化程度與年齡無相關(guān)性。以10歲為年齡間隔，將樣本分為6個(gè)年齡組：0-10歲、11-20歲、21-30歲、31-40歲、41-50歲及>50歲。比較各年齡組間甲基化水平的差異，分析得出IGS4序列在年齡組間甲基化水平存在顯著差異。其余三條序列在各年齡組間甲基化程度無顯著差異。
　　3.2性別對(duì)四個(gè)non-CGI序列甲基化的

10、影響。通過比較不同性別間的甲基化水平，結(jié)果表明，在所檢測的四個(gè)non-CGI序列中，甲基化程度在不同性別之間無顯著差異。
　　3.3民族對(duì)四個(gè)non-CGI序列甲基化的影響。樣本志愿者來自六個(gè)民族：漢族、哈尼族、拉祜族、壯族、回族及彝族，由于后四組樣本較少，故本研究只分析漢族和哈尼族樣本的甲基化水平差異，發(fā)現(xiàn)IGS3、IGS6序列的甲基化水平在漢族與哈尼族之間表現(xiàn)出顯著差異。其余序列未表現(xiàn)出顯著性差異。
　　3.4吸煙對(duì)四個(gè)

11、non-CGI序列甲基化的影響。IGS4序列的CpG2、CpG4位點(diǎn)及IGS6序列的CpG3位點(diǎn)甲基化程度，吸煙組和不吸煙組表現(xiàn)出顯著差異，其余序列的甲基化水平在吸煙組與不吸煙組之間無明顯差異。
　　結(jié)論：
　　1.對(duì)四個(gè)CGI候選序列的樣本研究結(jié)果表明，該四個(gè)CGI序列的甲基化程度非常低，在檢測的76對(duì)MZT樣本中，CGIS1序列區(qū)分MZT的效能僅有7.89%，提示CGI區(qū)域DNA甲基化可能并不是區(qū)分MZT的理想?yún)^(qū)域。