LINe-1 DNA甲基化-鑒別同卵雙生個(gè)體的潛在遺傳標(biāo)記.pdf

1、目的:由于同卵雙生子（monozygotictwins，MZ）是由一個(gè)受精卵分裂成兩個(gè)胚胎進(jìn)而發(fā)育成的兩個(gè)個(gè)體，他們具有完全相同或極其相似的基因組DNA序列，應(yīng)用現(xiàn)有的DNA遺傳標(biāo)記無法有效區(qū)分MZ的兩個(gè)個(gè)體，導(dǎo)致一些與MZ有關(guān)的案件無法偵破。因此，如何從遺傳學(xué)角度準(zhǔn)確認(rèn)定MZ的兩個(gè)個(gè)體，是法醫(yī)學(xué)DNA分析領(lǐng)域亟待解決的難題。5-甲基胞嘧啶(5-methylcystein，5mC)即在胞嘧啶的第5位碳原子上添加一個(gè)甲基，被稱作第6種堿基

2、，是一種重要的表觀遺傳現(xiàn)象。近來研究發(fā)現(xiàn)MZ個(gè)體之間5mC存在差異。本課題組前期研究檢測(cè)了1對(duì)新生兒MZ的全基因組甲基化譜，發(fā)現(xiàn)有2205條存在DNA甲基化差異的序列，這些差異序列大部分分布在重復(fù)序列，尤以散在重復(fù)序列為著，如短散布元件Alu序列和長(zhǎng)散布元件(longinterspersedelements，LINE-1)。LINE-1在人類基因組的拷貝數(shù)大于50萬，占人類基因組的17％，因此其甲基化程度可代表核基因組的甲基化程度。本研

3、究擬對(duì)LINE-1序列的DNA甲基化水平進(jìn)行大樣本雙生子調(diào)查，以評(píng)估其鑒別MZ的能力以及潛在的應(yīng)用價(jià)值。
　　 方法:按照知情同意原則，收集了176對(duì)雙生子血液樣本及漱口水樣本。應(yīng)用QIAampDNABloodkit提取血液樣本的全基因組DNA，應(yīng)用漱口水提取試劑盒提取漱口水的全基因組DNA。用GoldeneyeDNA身份鑒定系統(tǒng)BASIC試劑盒檢測(cè)DNA樣本的19個(gè)常染色體短串聯(lián)重復(fù)序列(shorttandemrepeat，S

4、TR)基因座分型，以確定每對(duì)雙生子樣本的同異卵情況。應(yīng)用EZDNAMethylation-GoldKit對(duì)基因組DN進(jìn)行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化，以轉(zhuǎn)化的DNA為模板，擴(kuò)增LINE-I靶序列。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行單鏈純化后，用PyroMarkGoldQ96Reagents和PyroMarkID焦磷酸測(cè)序儀進(jìn)行焦磷酸測(cè)序反應(yīng)，每個(gè)樣本重復(fù)三次，獲得LINE-1序列3個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化程度的定量數(shù)據(jù)。應(yīng)用主成份分析、Spearman相關(guān)檢驗(yàn)、配對(duì)t檢驗(yàn)、方

5、差分析、秩和檢驗(yàn)等方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 結(jié)果:
　　 1樣本概況
　　 經(jīng)STR分型鑒定，176對(duì)血液樣本包含119對(duì)MZ和57對(duì)DZ，64對(duì)漱口水樣本包含50對(duì)MZ及14對(duì)DZ。
　　 2LINE-1靶序列DNA甲基化水平及位點(diǎn)間的相關(guān)性分析
　　 在所調(diào)查的352個(gè)血液樣本中，3個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化平均值分別為81.26％、73.91％、74.74％;在128個(gè)漱口水樣本中，分別為73.1

6、8％、69.86％、67.85％，明顯低于血液樣本。配對(duì)t檢驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)，3個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化在同一個(gè)體血液與漱口水樣本中存在顯著差異，漱口水樣本中的甲基化程度顯著低于血液中的甲基化程度。此外，相關(guān)系數(shù)矩陣分析顯示3個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化具有一定的相關(guān)性。
　　 3MZ、DZ個(gè)體間LINE-1DNA甲基化水平差異分析
　　 每對(duì)MZ或DZ兩個(gè)個(gè)體之間甲基化水平進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，結(jié)果顯示其中15對(duì)MZ及10對(duì)DZ兩個(gè)個(gè)體之間甲基

7、化水平具有顯著差異，分別占MZ及DZ總樣本量的12.61％及17.54％，表明本研究選取的3個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化能夠鑒別12.61％的MZ和17.54％的DZ，即其鑒別DZ的能力略高于MZ。通過對(duì)MZ及DZ兩個(gè)個(gè)體間甲基化差異與年齡進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)無論MZ還是DZ，其差異均與年齡無明顯相關(guān)性。比較MZ之間與DZ之間甲基化差值的差異程度，發(fā)現(xiàn)二者無顯著差異。
　　 4年齡和性別對(duì)LINE-1DNA甲基化的影響
　　 提供

8、血液樣本的志愿者包括176對(duì)雙生子，年齡0～74歲。我們按照10歲的年齡段將樣本分為5個(gè)年齡組:0-10歲、11-20歲、21-30歲、31-40歲、41-50歲及＞50歲。通過主成分分析，分別應(yīng)用PC1及CpGmean（焦磷酸測(cè)序儀測(cè)出的3個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化水平的平均值）與年齡及性別進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示:在血液樣本中，年齡與PC1及CpGmean值均沒有明顯的相關(guān)性，秩和檢驗(yàn)結(jié)果也表明各年齡組間的PC1值及CpGmean值均無統(tǒng)計(jì)

9、學(xué)差異。但在漱口水樣本中，PC1及CpGmean值與年齡均呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0382和0.378;各年齡組間的PC1值及CpGmean值也具有顯著性差異。
　　 樣本的性別組成:血液樣本包括168名男性及184名女性，漱口水樣本包括44名男性及84名女性。在漱口水樣本，男性與女性之間的PC1值及CpGmean值無顯著性差異，而在血液樣本，女性樣本的CpGmean及PC1的平均值略低于男性樣本，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　

10、 5不同民族和居住地對(duì)LINE-1DNA甲基化的影響
　　 樣本志愿者來自三個(gè)民族:漢族、哈尼族及彝族，漢族志愿者主要來自河北和山西，少數(shù)來自云南，哈尼族和彝族志愿者均來自云南。相關(guān)分析及秩和檢驗(yàn)均表明來自不同民族、不同居住地的樣本的LINE-1DNA甲基化程度均無顯著差異，表明民族和居住地對(duì)其無影響。
　　 6職業(yè)和教育程度對(duì)LINE-1DNA甲基化的影響
　　 為評(píng)價(jià)不同職業(yè)對(duì)LINE-1DNA甲基化是否有影

11、響，將樣本分為腦力勞動(dòng)組（88個(gè)血液樣本、37個(gè)漱口水樣本）、體力勞動(dòng)組（31個(gè)血液樣本、10個(gè)漱口水樣本）、未成年人組（68個(gè)血液樣本、30個(gè)漱口水樣本）及其他(21個(gè)血液樣本、11個(gè)漱口水樣本)。相關(guān)分析及秩和檢驗(yàn)結(jié)果表明，無論在血液樣本還是漱口水樣本，不同職業(yè)的PC1及CpGmean的平均值均具有顯著差異。
　　 為進(jìn)一步探討教育程度是否也是LINE-1DNA甲基化的影響因素，將樣本分為四種教育程度:碩士及以上程度（5個(gè)血

12、液樣本、0個(gè)漱口水樣本）、大學(xué)程度（16個(gè)血液樣本、7個(gè)漱口水樣本）、中學(xué)程度（16個(gè)血液樣本、10個(gè)漱口水樣本）、小學(xué)程度（136個(gè)血液樣本、73個(gè)漱口水樣本）。血液樣本PC1值及CpGmean與教育程度均具有相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)分別為0.162及0.161。秩和檢驗(yàn)也證實(shí)，PC1值及CpGmean在不同教育水平之間的差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 7吸煙對(duì)LINE-1DNA甲基化的影響
　　 無論血液樣本還是漱口水樣本，吸煙

13、組與不吸煙組的LINE-1DNA甲基化PC1值及CpGmean的平均值均無顯著差異。
　　 結(jié)論:本研究應(yīng)用焦磷酸測(cè)序技術(shù)對(duì)LINE-1序列中的3個(gè)CpG位點(diǎn)DNA甲基化進(jìn)行定量分析，可鑒別MZ個(gè)體，鑒別能力為12.61％。雖然鑒別能力不高，但為解決法醫(yī)學(xué)MZ識(shí)別難題提供了初步可行的解決方案，后續(xù)研究將增加檢測(cè)的位點(diǎn)，提高檢測(cè)系統(tǒng)的累積鑒別能力，具有一定的應(yīng)用前景。由于LINE-1DNA甲基化具有組織差異性及年齡相關(guān)性，在實(shí)際應(yīng)