原癌基因MET介導上皮-間質轉化調控鼻咽癌獲得性放療抵抗的作用機制研究.pdf

1、第一部分放射線誘導鼻咽癌細胞上皮-間質轉化的作用研究
　　目的：檢測放射線對鼻咽癌細胞上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）的影響，探討EMT在鼻咽癌獲得性放療抵抗中的作用。
　　方法：X射線照射鼻咽癌細胞系HNE1、CNE2、CNE1、CNE1-LMP1；顯微鏡下觀察記錄細胞EMT形態(tài)學變化；Western blot技術檢測EMT標記分子、基質金屬蛋白酶2,9（mat

2、rix metalloproteinase2,9; MMP-2,9）蛋白水平變化；免疫熒光實驗檢測EMT標記分子的細胞定位與表達狀況；劃痕實驗檢測腫瘤細胞的遷移能力；Transwell實驗檢測腫瘤細胞的侵襲能力。
　　結果：X射線照射后，鼻咽癌細胞HNE1、CNE2、CNE1、CNE1-LMP1發(fā)生典型EMT形態(tài)學改變；Western blot結果顯示，照射后的鼻咽癌細胞以及放療抵抗鼻咽癌細胞中 E-cadherin表達減少，Vi

3、mentin、N-cadherin表達增多；免疫熒光實驗顯示：X射線照射后，鼻咽癌細胞間的E-cadherin表達量減少，而細胞漿內Vimentin表達量增多；劃痕實驗顯示：照射后的鼻咽癌細胞遷移能力增強。而Transwell實驗和Western blot結果顯示：X射線照射后，鼻咽癌細胞的侵襲能力未發(fā)生明顯變化；放療組與未放療組中鼻咽癌細胞MMP-2、MMP-9蛋白表達水平無明顯差異。
　　結論：放射線可誘導鼻咽癌細胞出現(xiàn)典型E

4、MT改變，而放療抵抗鼻咽癌細胞具有間質細胞表型特征。研究結果提示，EMT參與鼻咽癌細胞的獲得性放療抵抗。
　　第二部分放射線激活MET及其介導鼻咽癌上皮-間質轉化與放療抵抗的作用研究
　　目的：檢測放射線對原癌基因MET及下游信號分子的激活情況，探討MET基因在放射線誘導鼻咽癌上皮-間質轉化（EMT）以及鼻咽癌獲得性放療抵抗中的作用。
　　方法：X射線照射鼻咽癌細胞系 HNE1、CNE2、CNE1、CNE1-LMP1；

5、ELISA實驗檢測鼻咽癌細胞中HGF自分泌水平；Real-time PCR（RT-PCR）實驗檢測鼻咽癌細胞中MET mRNA表達水平；Western blot技術檢測鼻咽癌細胞中c-Met及下游信號分子的活化情況；慢病毒轉染RNA干擾技術沉默MET基因表達，RT-PCR、Western blot技術檢測MET基因沉默效應；克隆形成實驗用于檢測X射線照射后的細胞克隆形成率，并繪制細胞生存曲線以比較細胞增殖能力。
　　結果：X射線照

6、射后，鼻咽癌細胞自分泌HGF水平輕度升高，而MET mRNA及c-Met蛋白表達水平明顯升高；X射線可激活c-Met及其下游信號分子，照射后的鼻咽癌細胞中p-c-Met、p-Stat3、p-Akt、p-erk1,2蛋白量表達增多；MET基因沉默鼻咽癌細胞組中，放射線誘導的EMT改變受到抑制、c-Met下游信號分子活化減弱、鼻咽癌細胞增殖能力降低。
　　結論：放射線可激活c-Met及其下游信號分子；而沉默MET基因可阻斷放射線誘導的

7、EMT改變以及c-Met信號活化，并增加鼻咽癌細胞的放療敏感性。研究結果提示，MET基因在放射線誘導EMT以及鼻咽癌放療抵抗中發(fā)揮重要作用。
　　第三部分 MET介導上皮-間質轉化調控鼻咽癌放療抵抗的分子機制探討
　　目的：探討MET基因介導上皮-間質轉化調控鼻咽癌放療抵抗的可能分子機制。
　　方法： Western blot技術檢測照射后鼻咽癌細胞中E-cadherin、β-catenin、c-Myc、Cyclin

8、D1分子表達情況。免疫熒光實驗檢測放療前后E-cadherin、β-catenin的細胞定位以及表達情況。流式細胞術檢測X射線照射后鼻咽癌細胞的細胞周期分布、細胞凋亡情況。
　　結果：Western blot結果顯示，鼻咽癌細胞照射后出現(xiàn)E-cadherin表達減少，β-catenin入核增多；而沉默MET基因后，核內β-catenin表達量降低，同時下游靶基因c-Myc、Cyclin D1表達減少。免疫熒光實驗顯示：X射線照射后

9、，鼻咽癌細胞之間的E-cadherin蛋白表達減少，β-catenin入核增多，而沉默MET基因后，β-catenin入核減少。流式細胞術結果表明：MET基因沉默組與隨機序列對照組相比，X射線照射引起的G2/M期細胞比例顯著增加、細胞凋亡率升高。
　　結論：沉默 MET基因可引起鼻咽癌細胞β-catenin入核減少、β-catenin下游靶分子c-Myc、Cyclin D1表達量降低，而且可以導致鼻咽癌細胞發(fā)生G2/M期阻滯、細胞