RNA干擾原癌基因c-Met對鼻咽癌作用的影響及其機制研究.pdf

1、第一部分：
　　 目的：檢測原癌基因c-Met在鼻咽癌組織中的表達及臨床意義，探討其在鼻咽癌侵襲轉(zhuǎn)移過程中的作用。
　　 方法：采用免疫組織化學SP 法和RT-PCR分別檢測31例鼻咽癌及10例慢性鼻咽炎性組織中c-Met 蛋白及c-Met mRNA的表達水平，并聯(lián)系其臨床病理資料。
　　 結(jié)果：c-Met 蛋白在鼻咽癌活檢組織中的陽性表達率明顯高于鼻咽炎性組織，差異有極顯著性。C-Met的表達與鼻咽癌的臨床分期

2、、伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)；與年齡、性別、組織分型均無相關(guān)。C-Met mRNA在鼻咽癌活檢組織中的表達水平明顯高于鼻咽炎性組織，差異有顯著性。
　　 結(jié)論：鼻咽癌組織中c-Met 蛋白及mRNA 水平均存在高表達，c-Met的高表達與其侵襲和轉(zhuǎn)移有密切的關(guān)系，c-Met 可作為鼻咽癌臨床治療及預后的參考指標。
　　 第二部分：
　　 目的：設(shè)計以人c-Met基因為靶向的shRNA，構(gòu)建攜帶此shRNA的重組質(zhì)粒，檢測

3、其抑制c-Met表達的效應，篩選RNA 干擾作用最強的shRNA 片段。
　　 方法：針對c-Met基因的mRNA 序列設(shè)計3個干擾靶點，分別構(gòu)建3個shRNA 質(zhì)粒表達載體和1個隨機序列質(zhì)粒表達載體，經(jīng)大腸桿菌擴增，酶切、PCR、測序鑒定，用脂質(zhì)體介導的方法將其轉(zhuǎn)染至鼻咽癌CNE-2細胞中，采用real-time PCR和westernblot 檢測c-Met基因在mRNA和蛋白表達情況，比較轉(zhuǎn)染前后其表達差異，判斷各shRN

4、A的干擾效應。
　　 結(jié)果：經(jīng)測序證實，成功構(gòu)建pGP-silencer-U6/Neo/GFP/c-Met 真核表達質(zhì)粒。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CNE-2細胞后，c-Met基因的mRNA 水平及蛋白水平明顯下調(diào)，其中以2 號重組質(zhì)粒效應最強，mRNA 水平下調(diào)90％，蛋白水平下調(diào)75％。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建了針對c-Met基因的RNAi 重組質(zhì)粒，為下一步研究c-Met基因?qū)Ρ茄拾〤NE-2細胞生物學行為的功能奠定了基礎(chǔ).

5、>　　 第三部分：
　　 目的：探討c-Met shRNA 真核表達載體對人鼻咽癌CNE-2細胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及凋亡作用的影響。
　　 方法：建立轉(zhuǎn)染pGP-silencer-U6/Neo/GFP/c-Met 真核表達質(zhì)粒和隨機序列對照質(zhì)粒的穩(wěn)定單克隆細胞，分別采用CCK-8、基質(zhì)膠粘附實驗、體外遷移實驗、transwell 體外侵襲實驗、流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染前后細胞增殖能力、細胞粘附率、細胞運動能力、細胞侵襲能力及細

6、胞凋亡率的變化。
　　 結(jié)果：c-Met表達下調(diào)后，CNE-2細胞的增殖能力、細胞對基質(zhì)膠的粘附率明顯降低，CNE-2細胞的體外遷移能力、侵襲能力明顯降低，CNE-2細胞凋亡率增加。
　　 結(jié)論：原癌基因c-Met 明顯地促進了鼻咽癌CNE-2細胞株的體外增殖、粘附、遷移和侵襲能力，抑制了鼻咽癌CNE-2細胞的凋亡。提示c-Met在鼻咽癌的惡性進展中起重要作用，是一個潛在的鼻咽癌治療靶點。
　　 第四部分：

7、>　　 目的：探討c-Met shRNA 真核表達載體對人鼻咽癌CNE-2細胞裸鼠移植瘤生長的影響。
　　 方法：建立鼻咽癌裸鼠移植瘤模型，觀察c-Met shRNA 真核表達載體的抗瘤療效，分別在CNE-2細胞形成的移植瘤的體部和基底部多點微量注射c-Met shRNA 真核表達載體質(zhì)粒，注射等體積的隨機質(zhì)粒載體和生理鹽水作為對照組，記錄腫瘤體積的增長曲線，并在4周后處死裸鼠，取出移植瘤，用Western Blot 及TUN

8、EL分別檢測移植瘤中原癌基因c-Met 蛋白的表達水平和腫瘤細胞原位凋亡率。
　　 結(jié)果：36只裸鼠無一死亡，體重均勻增加，成瘤率100％。在注射組中，c-Met shRNA真核表達載體組的腫瘤體積的增長均比相應的注射隨機質(zhì)粒載體和生理鹽水組要慢。取出的移植瘤中c-Met 蛋白的表達和原位TUNEL 檢測結(jié)果提示：移植瘤中相對于生理鹽水對照組和隨機質(zhì)粒對照組，c-Met shRNA 真核表達載組c-Met 蛋白表達明顯下降；移植