IL-1β對(duì)外周神經(jīng)系統(tǒng)華勒變性中施旺細(xì)胞的影響.pdf

1、研究目的:
　　通過(guò)改進(jìn)后的大鼠坐骨神經(jīng)體外華勒氏變性模型，進(jìn)一步確認(rèn)該模型的可靠性，并以該模型為基礎(chǔ)，研究外周神經(jīng)系統(tǒng)華勒變性早期施旺細(xì)胞IL-1β的表達(dá)情況，以及IL-1β對(duì)施旺細(xì)胞去分化、增殖及凋亡影響，并研究探討相關(guān)的作用機(jī)制，希望以此為窗口來(lái)探尋局部組織損傷后炎癥因子對(duì)成體細(xì)胞去分化及組織再生的影響。
　　研究方法:
　　1.體外華勒氏變性模型的制備及分組干預(yù).
　　2.Real time PCR測(cè)定體

2、外華勒氏變性模型中不同時(shí)間點(diǎn)(6H、12H、24 H)施旺細(xì)胞IL-1β mRNA表達(dá)量。
　　3.Elisa測(cè)定體外華勒氏變性模型中不同時(shí)間點(diǎn)(12H、24 H、36H、48H)施旺細(xì)胞IL-1β蛋白的表達(dá)量。
　　4.體外華勒氏變性模型不同濃度IL-1β干預(yù)（0 ng/ml、5 ng/ml和50 ng/ml）48小時(shí)后，免疫熒光染色標(biāo)記施旺細(xì)胞去分化指標(biāo)p75NTR和分化指標(biāo)MPZ，并且Western Blot分別檢測(cè)并

3、量化比較p75NTR和MPZ蛋白表達(dá)量。
　　5.體外華勒氏變性模型中0 ng/ml（對(duì)照組）或5 ng/ml IL-1β干預(yù)后，Realtime PCR檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)(6H、12H、24 H)去分化指標(biāo)p75NTR和分化指標(biāo)MPZ mRNA表達(dá)量。
　　6.體外華勒氏變性模型不同濃度IL-1β干預(yù)（0 ng/ml和5 ng/ml）24小時(shí)，免疫熒光染色標(biāo)記施旺細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子c-Jun，并統(tǒng)計(jì)比較c-Jun陽(yáng)性率;Wester

4、nBlot檢測(cè)進(jìn)一步量化比較轉(zhuǎn)錄因子c-Jun表達(dá)量差異。
　　7.體外華勒氏變性模型中0 ng/ml（對(duì)照組）或5 ng/ml IL-1β干預(yù)后，Realtime PCR檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)(6H、12H、24 H)轉(zhuǎn)錄因子c-Jun mRNA表達(dá)量。
　　8.體外華勒氏變性模型中0 ng/ml（對(duì)照組）或5 ng/ml IL-1β干預(yù)后，AP-1activity assay檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)(6H、12H、24 H)核轉(zhuǎn)錄激活蛋白

5、1(AP-1)的活性相對(duì)值。
　　9.體外華勒氏變性模型不同濃度IL-1β干預(yù)（0 ng/ml和5 ng/ml）48小時(shí)，免疫熒光染色標(biāo)記施旺細(xì)胞增殖標(biāo)記Ki67，并統(tǒng)計(jì)比較Ki67陽(yáng)性率（即細(xì)胞增殖率）。
　　10.體外華勒氏變性模型不同濃度IL-1β干預(yù)（0 ng/ml和5 ng/ml）48小時(shí)，Tunel法染色標(biāo)記施旺細(xì)胞細(xì)胞凋亡情況，并統(tǒng)計(jì)各組Tunel陽(yáng)性率（即細(xì)胞凋亡率）。
　　11.體外華勒氏變性模型不同

6、濃度IL-1β干預(yù)（0 ng/ml和5 ng/ml）24小時(shí)，Western Blot檢測(cè)細(xì)胞凋亡促進(jìn)蛋白Bax和細(xì)胞凋亡抑制蛋白Bcl-2蛋白表達(dá)量，統(tǒng)計(jì)比較Bcl-2和Bax表達(dá)量以及Bcl-2/Bax比值。
　　12.數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法.
　　研究結(jié)果：
　　1.體外華勒氏變性模型中施旺細(xì)胞IL-1βmRNA和IL-1β蛋白表達(dá)量變化
　　大鼠坐骨神經(jīng)受損離體后華勒氏變性過(guò)程中施旺細(xì)胞IL-1βmRN

7、A和IL-1β蛋白表達(dá)量逐漸增高，IL-1βmRNA于12小時(shí)較對(duì)照組升高了近7倍達(dá)到高峰期，隨后開始有所降低;IL-1β蛋白分泌量逐漸增高，于36小時(shí)較對(duì)照組升高了近4倍達(dá)到高峰期，隨后開始有所降低。
　　2.IL-1β干預(yù)后體外華勒氏變性模型中p75NTR和MPZ表達(dá)情況
　　LSD法檢驗(yàn)不同濃度組與對(duì)照組0 ng/ml之間的表達(dá)差異），5 ng/ml濃度組較對(duì)照組0 ng/ml中p75NTR表達(dá)量顯著升高(p=0.00

8、8)，MPZ表達(dá)量顯著降低(p=0.005);50ng/ml濃度組較對(duì)照組0 ng/ml中p75NTR以及MPZ表達(dá)量差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Western Blot檢測(cè)與免疫熒光染色結(jié)果一致。
　　3.IL-1β干預(yù)后體外華勒氏變性模型中p75NTR和MPZ mRNA表達(dá)情況
　　Real time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，IL-1β干預(yù)后體外華勒氏變性模型中施旺細(xì)胞p75NTR mRNA表達(dá)量顯著升高，而MPZ mRNA表達(dá)量顯著

9、降低。
　　4.IL-1β干預(yù)后體外華勒氏變性模型中轉(zhuǎn)錄因子c-Jun表達(dá)情況
　　適當(dāng)濃度（5 ng/ml）IL-1β可促進(jìn)坐骨神經(jīng)華勒氏變性過(guò)程中施旺細(xì)胞細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子c-Jun表達(dá)。
　　5.IL-1β干預(yù)后體外華勒氏變性模型中c-Jun mRNA表達(dá)情況
　　適當(dāng)濃度(5 ng/ml) IL-1β可促進(jìn)坐骨神經(jīng)華勒氏變性過(guò)程中施旺細(xì)胞細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子c-Jun表達(dá)。
　　6.IL-1β干預(yù)后體外華

10、勒氏變性模型中AP-1的活性變化情況
　　適當(dāng)濃度(5 ng/ml) IL-1β不僅促進(jìn)坐骨神經(jīng)華勒氏變性過(guò)程中施旺細(xì)胞細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子c-Jun表達(dá)，而且增加華勒氏變性過(guò)程中施旺細(xì)胞AP-1的活性。
　　7.IL-1β干預(yù)后體外華勒氏變性模型中細(xì)胞增殖標(biāo)記Ki67表達(dá)情況
　　給于體外華勒氏變性模型不同濃度IL-1β干預(yù)(0 ng/ml和5 ng/ml)48小時(shí)，免疫熒光染色標(biāo)記施旺細(xì)胞增殖標(biāo)記Ki67，觀察可見(jiàn)Ki

11、67均主要位于細(xì)胞核內(nèi)，且5 ng/ml干預(yù)組Ki67表達(dá)量較0 ng/ml組有所升高;量化比較兩組之間施旺細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)Ki67陽(yáng)性率，5 ng/ml干預(yù)組Ki67陽(yáng)性率較0 ng/ml組顯著升高(t=-6.264，p=0.003)。免疫熒光染色顯示，適當(dāng)濃度(5 ng/ml) IL-1β可促進(jìn)坐骨神經(jīng)華勒氏變性過(guò)程中施旺細(xì)胞的增殖。
　　8.IL-1β干預(yù)后體外華勒氏變性模型中細(xì)胞凋亡情況
　　給于體外華勒氏變性模型不同

12、濃度IL-1β干預(yù)(0 ng/ml和5 ng/ml)48小時(shí)，Tunel法染色標(biāo)記施旺細(xì)胞細(xì)胞凋亡情況，并統(tǒng)計(jì)各組Tunel陽(yáng)性率（即細(xì)胞凋亡率）的差異，顯示5 ng/ml干預(yù)組凋亡率較0 ng/ml組顯著降低(t=4.274，p=0.013)。Tunel法細(xì)胞凋亡檢測(cè)顯示，適當(dāng)濃度(5 ng/ml) IL-1β可抑制坐骨神經(jīng)華勒氏變性過(guò)程中施旺細(xì)胞的凋亡。
　　9.IL-1β干預(yù)后體外華勒氏變性模型中Bax和Bcl-2表達(dá)情況<

13、br>　　給于體外華勒氏變性模型不同濃度IL-1β干預(yù)(0 ng/ml和5 ng/ml)24小時(shí)，Western Blot檢測(cè)細(xì)胞凋亡促進(jìn)蛋白Bax和細(xì)胞凋亡抑制蛋白Bcl-2蛋白表達(dá)量，顯示5 ng/ml濃度組較對(duì)照組0 ng/ml中施旺細(xì)胞凋亡抑制蛋白Bcl-2表達(dá)量顯著升高（t=-3.456，p=0.026），凋亡促進(jìn)蛋白Bax表達(dá)量顯著降低(t=3.052，p=0.038)，且Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)量比例顯著升高(t=-4.

14、397，p=0.012)。這與Tunel法凋亡細(xì)胞染色結(jié)果一致?？梢?jiàn)，適當(dāng)濃度(5 ng/ml) IL-1β可增加凋亡抑制蛋白Bcl-2表達(dá)量，降低凋亡促進(jìn)蛋白Bax表達(dá)量，從而抑制坐骨神經(jīng)華勒氏變性過(guò)程中施旺細(xì)胞凋亡。
　　研究結(jié)論：
　　本實(shí)驗(yàn)研究顯示，體外華勒氏變性模型是研究周圍神經(jīng)系統(tǒng)華勒氏變性過(guò)程中干預(yù)施旺細(xì)胞去分化影響因素的有效模型。通過(guò)該模型，我們研究進(jìn)一步證實(shí)華勒氏變性早期施旺細(xì)胞IL-1β mRNA表達(dá)量升

15、高，IL-1β蛋白分泌量增多，華勒氏變性可視為外周神經(jīng)系統(tǒng)應(yīng)對(duì)神經(jīng)損傷的固有免疫反應(yīng)。通過(guò)該模型給予相應(yīng)干預(yù)，我們研究發(fā)現(xiàn)適當(dāng)濃度的IL-1β具有促進(jìn)華勒氏變性過(guò)程中施旺細(xì)胞去分化的作用，以及促進(jìn)華勒氏變性過(guò)程中施旺細(xì)胞清除髓鞘碎片，從而促進(jìn)周圍神經(jīng)再生，而過(guò)高濃度的IL-1β對(duì)華勒氏變性過(guò)程中施旺細(xì)胞去分化以及髓鞘碎片的清除并無(wú)促進(jìn)作用。
　　本研究證實(shí)華勒氏變性早期適當(dāng)濃度的IL-1β具有促進(jìn)施旺細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子c-Jun mRN

16、A表達(dá)量，以及促進(jìn)施旺細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子c-Jun的高表達(dá)，并促進(jìn)施旺細(xì)胞內(nèi)AP-1活化;并認(rèn)為華勒氏變性早期IL-1β通過(guò)c-Jun/AP-1通路促進(jìn)施旺細(xì)胞去分化，以及促進(jìn)施旺細(xì)胞清除髓鞘碎片，從而促進(jìn)周圍神經(jīng)再生。
　　本研究證實(shí)華勒氏變性早期適當(dāng)濃度的IL-1β具有促進(jìn)施旺細(xì)胞增殖，以及增加Bcl-2表達(dá)量，減低Bax表達(dá)量，升高Bcl-2/Bax比值，抑制施旺細(xì)胞凋亡的積極作用;并認(rèn)為IL-1β通過(guò)促進(jìn)c-Jun/A