AML1-ETO陽性白血病APP基因的臨床意義、生物學功能及其作用機制研究.pdf

1、目的：本研究通過檢測44例AML1/ETO陽性的AML患者BMMNCs中APP的表達水平，并分析其表達水平高低與臨床療效及預(yù)后的關(guān)系，從而明確APP基因在該類型白血病患者的臨床意義。進一步通過慢病毒介導的RNA干擾(RNAinterference，RNAi)技術(shù)穩(wěn)定抑制伴有AML1/ETO融合基因陽性的Kasumi-1細胞系中的APP基因表達，觀察APP基因表達沉默對Kasumi-1細胞增殖、凋亡、遷移等生物學行為的影響，并初步探討了A

2、PP基因在調(diào)控AML1/ETO陽性白血病細胞遷移中的作用機制及藥物panobinostat干預(yù)，從而為探索AML1/ETO陽性的AML患者新的治療策略提供依據(jù)。
　　方法：
　　1.收集我院2007年6月～2013年12月期間確診為AML的住院患者骨髓標本44例（均為初診患者），且該44例患者經(jīng)染色體核型分析、原位熒光免疫雜交(FISH)和PCR檢測證實均存在t(8;21)(q22;q22)染色體異位和AML1/ETO融合基

3、因表達陽性。采用人外周血淋巴細胞分離液分離出骨髓單個核細胞，熒光定量PCR實驗方法檢測患者BMMNCs中APP mRNA相對于內(nèi)參β-actin的表達水平。
　　2.以APP基因的mRNA表達中位水平為界，把低于和高于中位表達量的患者分成APP高表達組和APP低表達組。分析比較兩組患者白血病髓外浸潤（EMI）發(fā)生率、2療程總完全緩解(complete remission,CR)率，分析APP表達水平高低與AML1/ETO陽性的AM

4、L患者預(yù)后的關(guān)系。
　　3.利用RNAi技術(shù)抑制Kasumi-1細胞中的APP基因以研究其功能。應(yīng)用熒光定量PCR和westernblotting實驗檢測shRNA對Kasumi-1細胞中APP基因的干擾效果。
　　4.觀察APP基因表達穩(wěn)定沉默對Kasumi-1細胞增殖、周期、凋亡、分化和遷移能力的影響。
　　5.基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases，MMPs)的主要功能是降解細胞外基質(zhì)

5、成分，在腫瘤細胞遷移過程中發(fā)揮重要作用，其中MMP1、MMP2和MMP9已知與多種腫瘤細胞遷移密切相關(guān)。
　　6.Panobino stat藥物以不同濃度作用于Kasumi-1細胞，CCK8法檢測藥物作用48小時的IC50值。以明確panobinostat是否能有效干預(yù)APP介導的信號傳導通路。
　　結(jié)果：
　　1.檢測44例AML1/ETO陽性的AML患者BMMNCs中APP mRNA的相對表達中位水平為0.0097

6、93(0.0000413～0.08367)。
　　2.Kasumi-1細胞中的APP相對于內(nèi)參GAPDH的蛋白表達水平(1.3423±0.1152)顯著高于HL-60細胞(0.6254±0.0846，P＜0.001)和K562細胞(0.8227±0.0974,P＜0.001)，由此證實了APP在AML1/ETO陽性的Kasumi-1細胞中高表達。慢病毒轉(zhuǎn)染Kasumi-1細胞72h后，應(yīng)用流式細胞術(shù)無菌分選出Lv-shCon和Lv

7、-shAPP兩實驗組GFP陽性的細胞并在體外擴大培養(yǎng)，流式細胞術(shù)檢測Lv-shCon組的細胞GFP陽性率為(96.04±0.17)％、Lv-shAPP組的細胞GFP陽性率為(95.82±0.18)％，提示慢病毒成功轉(zhuǎn)染Kasumi-1細胞。
　　3.APP基因表達抑制后Kasumi-1細胞在24、48、72和96h時間點的OD450平均值稍低于對照組（Con和Lv-shCon組），說明細胞的增殖能力輕度受損，然而差異經(jīng)分析無統(tǒng)計學

8、意義(P＞0.05)。流式細胞術(shù)分析三組細胞的周期分布情況，發(fā)現(xiàn)Lv-shAPP組細胞G0/G1期的比例與Con組比較無顯著差異(36.37±3.73 vs36.25±9.01，P=0.985)，S期和G2/M期的比例分別與Con組比較(28.19±6.08 vs26.21±5.13，P=0.663;33.07±2.74 vs34.25±2.92，P=0.771），差異均無統(tǒng)計學意義。流式細胞術(shù)分析三個實驗組細胞的凋亡比例結(jié)果示，Lv-

9、shAPP組細胞總凋亡率（即早期和晚期細胞凋亡率之和）平均值稍高于Con和Lv-shCon組。然而，Lv-shAPP組細胞的總凋亡率與Con組和Lv-shCon組比較，差異經(jīng)統(tǒng)計軟件分析均無統(tǒng)計學意義（8.40±0.96％ vs6.80±0.46％，P=0.065;8.40±0.96％vs7.10±1.06％，P=0.116）。Lv-shAPP組的Kasumi-1細胞CD11b陽性比例為6.63±0.66％，與Con組(5.69±0.5

10、0％)和Lv-shCon組的細胞CD11b陽性率(6.29±0.50％)比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P值均＞0.05）。采用Transwell小室檢測沉默APP表達后細胞體外遷移運動能力的變化，下室細胞計數(shù)并計算細胞遷移率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Lv-shAPP組下室細胞比例(7.50±0.83％)較對照組顯著減少(12.78±2.1％，P=0.004)。結(jié)果表明APP基因表達沉默后Kasumi-1細胞的遷移運動能力顯著降低，對細胞增殖、凋亡和周期的

11、影響較小。
　　4.APP基因表達沉默后，western blotting方法檢測MMP2的蛋白水平顯著減低(P＜0.001)，而MMP1和MMP9的表達無顯著改變（P值均＞0.05）。檢測MMPs的上游調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子c-Myc和Ets1的蛋白表達水平發(fā)現(xiàn)，與Con組的c-Myc表達水平(0.7024±0.0179)和Ets1的表達水平(0.1035±0.0177)比較，Lv-shAPP組的c-Myc蛋白水平顯著下調(diào)(0.0896±

12、0.0160，P＜0.001)，而Ets1的表達水平無顯著改變(0.0996±0.0097，P=0.727)。其中Lv-shCon和Con組比較，c-Myc和Ets1的表達水平差異均無統(tǒng)計學意義（P值均＞0.05）。進一步檢測c-Myc的上游調(diào)控基因p-ERK和ERK的表達變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與Con組的p-ERK表達水平(0.1666±0.0162)比較，Lv-shAPP組的p-ERK蛋白水平顯著下調(diào)(0.0183±0.007，P＜0.00

13、1)，三組細胞的ERK表達水平相互比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P值均＞0.05）。
　　5.Panobino stat(PS)對Kasumi-1細胞的抑制作用呈濃度和時間依賴性，對Kasumi-1細胞作用48h的IC50濃度為20nM。Panobinostat以不同濃度5、10、20、40和80nM分別作用Kasumi-1細胞48h，Western blotting檢測結(jié)果示APP、p-ERK、c-Myc和MMP2的表達水平均隨著p

14、anobinostat濃度的增加而下調(diào)，呈濃度依賴性。說明Panobinostat能夠有效抑制APP基因的表達，從而干預(yù)APP介導的信號通路。另外，panobinostat抑制APP基因表達的藥物濃度，同時能顯著抑制Kasumi-1細胞增殖、誘導細胞凋亡和導致細胞壞死。
　　結(jié)論：
　　1.AML1/ETO陽性AML患者中，APP基因高表達組的髓外浸潤發(fā)生率顯著高于低表達組，且CR率、OS率和RFS率均顯著低于APP基因低表

15、達患者，同時OS期和RFS期也顯著短于APP基因低表達組。提示APP基因高表達是一個AML1/ETO陽性的AML患者預(yù)后不良的因素。
　　2.慢病毒介導的APP特異性shRNA序列能有效地穩(wěn)定抑制Kasumi-1細胞的APP基因表達，APP基因表達穩(wěn)定抑制能顯著減弱Kasumi-1細胞的體外遷移能力，而無顯著抑制細胞增殖、誘導細胞凋亡和阻滯細胞周期的效應(yīng)。
　　3.APP基因表達抑制后檢測到MMP2、c-Myc和p-ERK的

16、蛋白水平顯著減低，說明APP基因可能通過ERK信號通路介導Kasumi-1細胞的遷移能力。因此，APP/ERK/c-Myc/MMP2信號通路可能是APP基因調(diào)控AML1/ETO陽性的白血病細胞的遷移機制之一。
　　4.組蛋白去乙酰化酶抑制劑panobinostat作用能顯著下調(diào)Kasumi-1細胞中的APP、p-ERK、c-Myc和MMP2的表達水平，呈濃度依賴性，說明panobinostat能夠有效抑制APP基因的表達，從而干預(yù)