hDOT1L基因在急性白血病發(fā)病機(jī)制中的作用及其臨床意義.pdf

1、目的:白血病的發(fā)生和發(fā)展與表觀遺傳修飾異常密切相關(guān)，是細(xì)胞遺傳和表觀遺傳共同改變的結(jié)果。研究證實(shí)，白血病細(xì)胞周期調(diào)節(jié)異常、增殖失控與細(xì)胞周期蛋白異常表達(dá)或缺失有關(guān)，而凋亡受抑與促凋亡基因過(guò)甲基化和抗凋亡基因低甲基化息息相關(guān)。研究人員發(fā)現(xiàn)人類(lèi)DOT1酶(hDOT1L)是一類(lèi)新的組蛋白賴(lài)氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶，通過(guò)誘導(dǎo)組蛋白H3K79高甲基化活化急性髓系白血病（AML）中起關(guān)鍵作用的一套基因促使白血病的發(fā)生。本研究通過(guò)比較初治白血病患者和緩解后患者

2、及復(fù)發(fā)患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞（bone marrow mononuclear cells，BMMNC）中hDOT1L基因及其相關(guān)分子的表達(dá)和H3K79組蛋白的甲基化水平，并檢測(cè)PI3K/AKT信號(hào)通路中關(guān)鍵分子的表達(dá)變化分析兩者之間的關(guān)系，探討hDOT1L在白血病發(fā)病機(jī)制中的作用和臨床意義，并分析其可能的作用機(jī)制，以期揭示白血病治療的新靶點(diǎn)，為白血病的新藥研發(fā)及預(yù)后判斷提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　標(biāo)本采集:收集和提取健康志愿者、急性髓系

3、白血病(AML)患者、急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)患者、AML及ALL復(fù)發(fā)患者(AL-relapse)及緩解者(AL-CR)的BMMNC，骨髓標(biāo)本均來(lái)自于2013年-2014年河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院血液科住院患者共82例。其中，AML組20例，ALL組20例，AL-relapse組22例(AML復(fù)發(fā)12例，ALL復(fù)發(fā)10例)，AL-CR組共20例（其中AML-CR10例，ALL-CR10例），正常對(duì)照組健康志愿者20例。實(shí)驗(yàn)組82例患者中

4、，男45例，女37例，年齡17-78歲，中位年齡47.5歲，對(duì)照組共20例，男8例，女12例，年齡23-68歲，中位年齡45.5歲。所有患者均經(jīng)過(guò)MICM即細(xì)胞形態(tài)學(xué)(Morphology, M)、免疫學(xué)(Immunology,I)、細(xì)胞遺傳學(xué)(Cytogenetics，C)和分子生物學(xué)(Molecular,M)診斷，符合2008年WHO急性白血病診斷標(biāo)準(zhǔn)。緩解患者均經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)方案一個(gè)療程化療達(dá)完全緩解。所有骨髓標(biāo)本提取單個(gè)核細(xì)胞，并于-8

5、0℃冰箱凍存。
　　方法:
　　1、Realtime-PCR(RT-PCR)檢測(cè)各組BMMNC內(nèi)hDOT1L、HOXA9、HOXA10、MLL-AF10(MLLT10)的mRNA表達(dá)水平。
　　2、Western Blot法檢測(cè)各組hDOT1L蛋白的表達(dá)及H3K79甲基化水平。
　　3、Western Blot法檢測(cè)各組PI3K、AKT、CDK4及CyclinD1蛋白的表達(dá)水平。
　　4、分析細(xì)胞周期與hD

6、OT1L及PI3K/AKT信號(hào)通路的相關(guān)性，探討hDOT1L信號(hào)通路與PI3K/AKT信號(hào)通路之間的內(nèi)在聯(lián)系。
　　5、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)。
　　結(jié)果:
　　1、hDOT1L、HOXA9、HOXA10、MLL-AF10基因的mRNA表達(dá)水平。
　　RT-PCR結(jié)果顯示，所有患者BMMNC中hDOT1L、HOXA9、HOXA10、MLL-AF10基因在mRNA水平均有表達(dá)，AML組、ALL組及AL-relapse組BM

7、MNC中上述基因mRNA水平明顯高于正常對(duì)照組和AL-CR，且差異顯著(P＜0.01);AML組、ALL組及AL-ralapse組組間比較及AL-CR組與正常對(duì)照組比較均無(wú)明顯差異（P＞0.05）。
　　2、hDOT1L的蛋白的表達(dá)及H3K79甲基化水平
　　Western Blot檢測(cè)結(jié)果表明，AML組和ALL組及AL復(fù)發(fā)組BMMNC中hDOT1L和H3K79-me2（雙甲基）蛋白表達(dá)水平顯著高于正常對(duì)照組和AL緩解組，并

8、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01); AML組和ALL組及AL復(fù)發(fā)組之間比較及AL緩解組與正常對(duì)照組比較上述蛋白表達(dá)水平均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　3、PI3K、AKT、CDK4、CyclinD1蛋白的表達(dá)水平
　　Western Blot檢測(cè)結(jié)果提示，AML組、ALL組及AL-relapse組患者BMMNC中PI3K、AKT蛋白表達(dá)水平較正常對(duì)照組和AL-CR組明顯升高(P＜0.01);CDK4、CyclinD1蛋白在

9、AML組、ALL組和AL-relapse組表達(dá)水平顯著高于正常對(duì)照組和AL-CR組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。AML組、ALL組和AL-relapse之間比較及AL-CR組與正常對(duì)照組比較上述蛋白表達(dá)水平均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、hDOT1L是一種新型的組蛋白賴(lài)氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶，它通過(guò)提高H3K79的甲基化水平并誘導(dǎo)其下游HOXA9、HOXA10、MLL-AF10基因的表達(dá)參與了急性白血病的