白血病相關(guān)蛋白AML1-ETO與細(xì)胞凋亡的關(guān)系研究.pdf

1、細(xì)胞遺傳學(xué)研究顯示,大約40﹪的M2型急性髓性白血病(AML)病人存在t(8;21)染色體易位.該易位導(dǎo)致21號(hào)染色體上的.AML1基因和8號(hào)染色體上的ETO基因融合,表達(dá)AML1-ETO融合蛋白.其中,野生型AML1屬于轉(zhuǎn)錄因子,在造血細(xì)胞的分化發(fā)育中發(fā)揮重要作用,而ETO蛋白主要通過結(jié)合共抑制因子,并募集組蛋白去乙?；?發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制功能.體外研究表明,AML1-ETO能顯性負(fù)抑制野生型AML1的轉(zhuǎn)錄激活作用,干擾造血細(xì)胞的正常分化

2、,促使白血病的發(fā)生.但是,各種轉(zhuǎn)基因小鼠實(shí)驗(yàn)顯示,僅有AML1-ETO的表達(dá)并不能誘發(fā)AML,AML1-ETO相關(guān)的白血病的發(fā)生可能還需要其它遺傳學(xué)改變的參與.另一方面,研究顯示,除了抑制造血細(xì)胞分化外,AML1-ETO蛋白也參與細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡過程. 本課題利用可誘導(dǎo)表達(dá).AML1-ETO的U937白血病細(xì)胞系-U937-A/E細(xì)胞,觀察AML1-ETO誘導(dǎo)表達(dá)對(duì)細(xì)胞凋亡的影響.結(jié)果發(fā)現(xiàn),AML1-ETO融合蛋白表達(dá)后,在各

3、種凋亡誘導(dǎo)劑(包括通過內(nèi)源性和/或外源性細(xì)胞凋亡信號(hào)途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的激活型Fas抗體、紫外線和新型喜樹堿衍生物NSC606985等)的作用下,U937-A/E細(xì)胞發(fā)生凋亡的敏感性顯著增加,并且凋亡過程中caspase-8、caspase-3的活化增強(qiáng).同時(shí),AML1-ETO可分別在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)凋亡相關(guān)基因Bak和Fas受體的表達(dá).考慮到AML1-ETO的促凋亡作用并不支持白血病的發(fā)生,我們推測體內(nèi)白血病的發(fā)生必定需要克服AML

4、1-ETO的促凋亡效應(yīng).的確,實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),t(8;21)陽性的細(xì)胞Kasumi-1和SKNO-1與其它白血病細(xì)胞的凋亡敏感性并沒有顯著差異.這些研究結(jié)果已經(jīng)在《LEUKEMIA》(影響因子為6.612)發(fā)表. 在上述研究過程中,意外發(fā)現(xiàn),不論是誘導(dǎo)表達(dá)的還是組成型表達(dá)的AML1-ETO都在凋亡過程中伴隨caspase-3的活化而降解產(chǎn)生70、49、40和25kDa四個(gè)片段.以此發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ),進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)caspase-3的特異性抑制

5、劑可以顯著抑制細(xì)胞凋亡過程中發(fā)生的.AML1-ETO降解.利用體外實(shí)驗(yàn)結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)證實(shí)AML1-ETO和野生型ETO是caspase-3的直接底物.通過定點(diǎn)致突變的方法識(shí)別出 TMPD<'188>和LLLD<'386>為AML1-ETO序列上caspase-3的作用位點(diǎn). 最后,對(duì)caspase-3剪切AML1-ETO在細(xì)胞凋亡中的作用進(jìn)行了研究.為此,分別構(gòu)建了AML1-ETO的各剪切片段及caspase-3剪切位點(diǎn)突變的AM

6、L1-ETO的四環(huán)素.關(guān)閉誘導(dǎo)表達(dá)的U937細(xì)胞系,發(fā)現(xiàn)D188和D368剪切位點(diǎn)同時(shí)突變的AML1-ETO喪失了促凋亡的能力,而189-752這一剪切片段與野生型AML1-ETO類似,可以顯著增強(qiáng)細(xì)胞的凋亡敏感性.表明AML1-ETO被caspase-3剪切是其凋亡增敏作用所必需的,并且189-752剪切片段介導(dǎo)了這一效應(yīng).因此,作為caspase-3的底物,AML1-ETO可以通過調(diào)控凋亡相關(guān)基因以及自身剪切等機(jī)制增強(qiáng)細(xì)胞的凋亡敏感