腸源性感染小鼠模型中主要危險因素的作用分析.pdf

1、目的：
　　研究廣譜抗生素、化療藥物及外源真菌對ICR小鼠腸黏膜機械屏障、生物屏障和免疫屏障的影響作用。
　　方法：
　　1.實驗處理:64只6周齡ICR雌性小鼠隨機分為8組，每組8只。分組設置為A組:無處理對照組;B組:單純使用廣譜抗生素溶液組（1mg/ml鹽酸萬古霉素、1mg/ml鹽酸克林霉素和0.2mg/ml硫酸慶大霉素混合溶液，口服;共18天）;C組:單純使用化療藥物組（實驗第8天時，200mg/kg5-氟尿嘧

2、啶，尾靜脈注射，一次）;D組:單純白色念珠菌灌胃組（實驗第9、10兩天分別給予1×109/ml白色念珠菌懸液灌胃0.3ml，共兩次）;E組:使用抗生素及化療藥物組（抗生素使用同B組，化療藥物使用同C組）;F組:使用抗生素并白色念珠菌灌胃組（抗生素使用同B組，白色念珠菌灌胃同D組）;G組:使用化療藥物并白色念珠菌灌胃組（化療藥物使用同C組，白色念珠菌灌胃同D組）;H組:使用抗生素及化療藥物并白色念珠菌灌胃組（抗生素使用同B組，化療藥物使用

3、同C組，白色念珠菌灌胃同D組）。
　　2.觀測指標:在處理過程中收集各組小鼠不同階段的糞便顆粒進行涂片革蘭染色觀察菌群大致結構;并對給予白色念珠菌灌胃組小鼠（D、F、G、H組）的糞便進行白色念珠菌培養(yǎng)計數，研究四組小鼠腸道內白色念珠菌含量的變化。記錄小鼠在0天（開始階段）、7天（抗生素飲用處理后）、10天（白色念珠茵灌胃處理后）和18天（處死前）的體重，并全程記錄不同組小鼠死亡情況;在實驗第18天時處死全部組小鼠，分別對各組小鼠肺

4、、肝、腎進行研磨勻漿，對勻漿中主要細菌和白色念珠菌進行菌落培養(yǎng)計數，比較各組小鼠細菌和真菌感染率;對臟器切片行蘇木精—伊紅染色法(HE)染色，觀察感染組小鼠各臟器的病理變化;采集處死后各組小鼠盲腸糞便，提取糞便全基因組DNA，利用qPCR法對腸道中總細菌、腸桿菌屬、雙歧桿菌屬、腸球菌屬、總真菌含量進行定量并對B/E值進行比較分析;采集處死時小鼠外周血，ELISA法檢測血清中主要細胞因子水平(IL-4、IL-10、IL-17、TNF-α、

5、IFN-γ)，并研究其在不同組別之間的差異。
　　結果：
　　1.實驗第7天時，各組小鼠體重均有所增加;第10天時E組和H組小鼠體重有較為明顯的下降，其他組小鼠體重變化不大;第18天時E組、G組和H組體重最低，并有不同數量的小鼠死亡，其中H組小鼠的生存率最低，為50％。
　　2.給予廣譜抗生素處理的B、E、F、H組在第7天時，糞便菌群數量和多樣性較對照組明顯減少，僅有少量的革蘭陰性桿菌/球菌，革蘭陽性菌少見或未見。單獨

6、給予化療處理的C組小鼠糞便菌群無明顯改變;而給予抗生素及化療處理的E組小鼠糞便涂片顯示在革蘭陽性桿菌數量明顯減少的同時，出現革蘭陽性球菌增多的現象。
　　3.給予白色念珠菌灌胃處理的D、F、G、H組糞便菌群在白念灌胃后第2天開始出現大量酵母菌，部分酵母菌呈現菌絲型。灌胃3-7天以后各組小鼠糞便中白色念珠菌數量呈現逐漸減少的趨勢，但H組小鼠在灌胃后的幾天糞便中仍維持較高載量(250.5×104 CFU/ml)的白色念珠菌。
　

7、　4.E組、G組和H組臟器培養(yǎng)結果顯示小鼠發(fā)生了腸源性臟器細菌感染，多數臟器細菌載量均達到104CFU/g數量級以上。而H組小鼠臟器同時有真菌感染，白色念珠菌載量介于103～104CFU/g之間。
　　5.小鼠臟器病理切片HE染色顯示:感染組小鼠（E、G、H組）臟器均出現了一定程度的病理改變:肺間質大量炎癥細胞浸潤，肺泡體積被擠壓變小;肝細胞水腫氣球樣變，肝竇受壓變窄，肝中央靜脈血流發(fā)現白色念珠菌胞體;腎小球體積變大，毛細血管腔狹

8、窄甚至閉塞，腎血管內也有白色念珠菌胞體可見;大腸和盲腸均出現明顯的腸黏膜細胞脫落壞死，腸黏膜間隙變大，杯狀細胞減少，黏膜肌層變薄等黏膜損傷表現。
　　6.總細菌:對照組（A組）小鼠腸道內總細菌量豐富，抗生素單用或聯(lián)用組腸道總細菌量下降較為顯著，其中三因素聯(lián)用組（H組）腸道總細菌量最低，與對照組有極顯著性差異。腸桿菌屬:對照組小鼠腸道腸桿菌屬含量處于較低水平，抗生素單用或聯(lián)用組腸道腸桿菌屬含量明顯增加，而單因素處理的兩組（C、D組）

9、以及聯(lián)用組（F、G組）腸桿菌屬含量則變化不大。雙歧桿菌屬:抗生素單用或聯(lián)用組腸道雙歧桿菌屬數量有所下降，與對照組有統(tǒng)計學差異。腸球菌屬:B-G組小鼠腸道腸球菌數量未見顯著性改變，僅H組小鼠腸道出現較大幅度的增加。總真菌:單獨接受白色念珠菌灌胃的D組小鼠第18天時腸道總真菌量與對照組無差異，提示白色念珠菌在該組小鼠胃腸道中出現了“一過性”現象，而H組小鼠總真菌數量大幅增加，與對照組有較顯著性差異。B/E值:對照組小鼠B/E值平均值達到1.

10、344，腸道定植抗力良好，而抗生素處理組別則下降明顯。
　　7.與對照組相比，除接受化療處理的C組IL-17水平下降明顯外，單獨抗生素處理（B組）或白色念珠菌灌胃處理組（D組）小鼠血清五種細胞因子水平均無顯著性變化;接受化療聯(lián)用的G組和H組細胞因子水平均出現不同程度的下降，而未接受化療處理的F組主要表現為炎癥因子IL-10、IL-17、TNF-α、IFN-γ水平的大幅度增高。
　　結論：
　　1.抗生素使用不當造成腸道