腸源性內(nèi)毒素在ConA誘導(dǎo)的小鼠肝炎模型中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、【研究背景及目的】
　　 肝炎是全世界范圍內(nèi)發(fā)病率較高的肝臟疾病之一，可由多種原因引起，如病毒感染、自身免疫功能紊亂、酗酒、藥物毒性、營養(yǎng)不良和膽汁淤積等，我國是肝炎高發(fā)國家，大部分肝炎是病毒感染引起，尤其是以HBV 感染為主。病毒性肝炎的主要發(fā)病機(jī)制是病毒抗原進(jìn)入機(jī)體后引起的免疫反應(yīng)造成肝細(xì)胞損傷，以細(xì)胞免疫反應(yīng)為主，主要的效應(yīng)細(xì)胞是特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞。病人免疫狀況不同導(dǎo)致肝炎的臨床表現(xiàn)各異。急性肝損傷（Acute li

2、ver failure）是由急性重型病毒性肝炎引起的致死性很高的肝臟疾病，病死率高達(dá)40-80％。大多數(shù)慢性病毒性肝炎病人在接受長期藥物治療后最終仍會發(fā)展為肝硬化、肝癌，肝臟的慢性炎癥是導(dǎo)致肝癌的重要原因，因此對病毒性肝炎的研究具有重要的臨床意義。自身免疫性肝炎（AIH）是一種病因不明的肝臟慢性炎癥疾病，在西方國家發(fā)病率較高，目前認(rèn)為細(xì)胞免疫反應(yīng)和體液免疫反應(yīng)均參與了其發(fā)病機(jī)制，細(xì)胞毒性T細(xì)胞是主要的致病因素,多數(shù)患者最終發(fā)展為肝硬化甚

3、至肝癌。
　　 刀豆蛋白A （ConA）是一種植物蛋白成分提取物，T淋巴細(xì)胞表面有其受體，為TCR、CD3等在內(nèi)的糖蛋白的糖殘基，肝臟是ConA作用的靶器官之一。由于肝內(nèi)存在Kupffer細(xì)胞、T細(xì)胞等大量免疫細(xì)胞，因此尾靜脈注射后ConA能夠經(jīng)血液循環(huán)特異性地與肝竇內(nèi)T細(xì)胞表面的受體結(jié)合并引起T細(xì)胞活化,從而導(dǎo)致肝臟炎癥及損傷。ConA 誘導(dǎo)的小鼠肝炎主要表現(xiàn)為轉(zhuǎn)氨酶的升高以及嚴(yán)重的肝臟病理損傷,可以很好地模擬病毒性肝炎、自身

4、免疫性肝炎等各種主要由免疫因素介導(dǎo)的肝臟疾病。
　　 由于解剖學(xué)上的聯(lián)系，肝臟長期暴露于較低濃度的腸道細(xì)菌及細(xì)菌產(chǎn)物的刺激下，并且肝臟是最主要的腸道菌群過濾器官。肝臟內(nèi)有大量的免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞以及B 淋巴細(xì)胞，因此正常肝臟能夠迅速有效地清除腸道來源的細(xì)菌及細(xì)菌產(chǎn)物。然而，當(dāng)肝臟的功能受損時，腸源性細(xì)菌產(chǎn)物可通過門靜脈或其側(cè)支循環(huán)進(jìn)入血液形成內(nèi)毒素血癥。腸源性內(nèi)毒素是強(qiáng)有力的致炎因子，能夠引起肝內(nèi)大量免疫

5、細(xì)胞的活化，從而引起肝內(nèi)大量炎癥因子的分泌，這些炎癥因子加重了肝臟已有炎癥的發(fā)生、發(fā)展。內(nèi)毒素（LPS）通過其受體Toll 樣受體4 （TLR4）發(fā)揮作用。TLR4與LPS 結(jié)合后，通過MyD88通路和TRIF通路活化下游信號，前者可引起多種炎癥介質(zhì)的釋放，后者則可引起I 型和II 型干擾素的釋放。在肝臟中，TLR4 也表達(dá)于Kupffer細(xì)胞、星狀細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞，在多種肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮重要作用。<

6、br>　　 本課題擬應(yīng)用ConA 誘導(dǎo)的小鼠肝炎模型研究腸源性內(nèi)毒素在免疫因素介導(dǎo)的肝炎中的作用，同時建立TLR4 敲除的小鼠ConA 肝炎模型，探討腸源性內(nèi)毒素LPS在本模型中的作用機(jī)制，為病毒性肝炎、自身免疫性肝炎等免疫因素介導(dǎo)肝炎的防治提供有潛在臨床價值的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
　　 【實(shí)驗(yàn)方法】
　　 1.建立ConA 誘導(dǎo)的小鼠肝炎模型，檢測注射ConA后小鼠體內(nèi)LPS水平；
　　 2.利用抗生素清除腸源性內(nèi)毒素

7、，比較抗生素處理組和對照組小鼠ConA 引起的肝損傷程度和LPS水平的變化；
　　 3.用抗生素清除小鼠腸源性內(nèi)毒素，比較抗生素處理組和對照組小鼠注射ConA后肝臟內(nèi)T細(xì)胞的浸潤情況以及CD4+T細(xì)胞的活化情況；
　　 4.用ELISA 方法檢測抗生素處理組和對照組小鼠注射ConA后血清中Th1和Th2 相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)情況；
　　 5.用Western Blot方法檢測抗生素處理組和對照組小鼠注射ConA后肝

8、臟組織中相關(guān)促進(jìn)和抑制凋亡分子的表達(dá)情況；
　　 6.比較LPS 受體Toll 樣受體4(TLR4)敲除小鼠和對照小鼠的ConA 引起的肝損傷程度；
　　 7.用流式細(xì)胞儀檢測TLR4 敲除小鼠和對照小鼠肝臟內(nèi)參與引起ConA 肝炎的T細(xì)胞的浸潤情況以及CD4+T細(xì)胞的活化情況；
　　 8.分離TLR4 敲除小鼠和對照小鼠脾細(xì)胞以及分選純化CD4+T細(xì)胞，體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證ConA對CD4+T細(xì)胞活化的影響；
　

9、　 9.用ELISA 方法檢測TLR4 敲除小鼠和對照小鼠注射ConA后血清中Th1和Th2 相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)情況；用Real-t ime PCR 方法檢測Th1細(xì)胞分化調(diào)節(jié)分子T-bet的表達(dá)情況；
　　 10.用Western Blot方法檢測TLR4 敲除小鼠和對照小鼠注射ConA后肝臟組織中相關(guān)促進(jìn)和抑制凋亡分子的表達(dá)情況；用Real-t ime PCR 方法檢測穿孔素Perforin和Granzyme B的表達(dá)情況

10、。
　　 【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】
　　 1.在ConA 誘導(dǎo)的小鼠肝炎模型中存在血清LPS水平的升高；
　　 2.抗生素處理組小鼠在ConA 注射后血清中LPS的升高明顯低于對照組，并且利用抗生素清除腸源性LPS 可明顯減輕ConA 引起的肝臟損傷及肝細(xì)胞凋亡；
　　 3.清除腸源性LPS能夠明顯降低ConA 引起的肝內(nèi)T細(xì)胞浸潤以及CD4+T細(xì)胞的活化；
　　 4.清除腸源性LPS能夠抑制ConA 引起的

11、Th1相關(guān)細(xì)胞因子的產(chǎn)生；
　　 5.清除腸源性LPS能夠明顯抑制ConA 引起的肝細(xì)胞凋亡；
　　 6.TLR4 缺失明顯減輕ConA 誘導(dǎo)的肝臟損傷和肝細(xì)胞的凋亡；
　　 7.TLR4 缺失抑制T細(xì)胞的肝內(nèi)浸潤并能有效抑制CD4+T細(xì)胞的活化；
　　 8.TLR4 缺失能夠抑制ConA 引起的Th1相關(guān)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，而促進(jìn)Th2 相關(guān)細(xì)胞因子IL-10的產(chǎn)生；
　　 9.TLR4 缺失能夠明

12、顯抑制ConA 引起的肝細(xì)胞凋亡；
　　 10.穿孔素/顆粒酶B 途徑可能參與了TLR4 缺失對肝細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。
　　 【結(jié)論】
　　 本研究證明腸源性LPS在ConA 誘導(dǎo)的免疫因素介導(dǎo)肝炎的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。腸源性LPS通過與其受體TLR4 結(jié)合，促進(jìn)ConA 引起的肝內(nèi)T細(xì)胞浸潤以及肝臟中的CD4+T細(xì)胞的活化，繼而促進(jìn)一系列Th1相關(guān)細(xì)胞因子的生成，從而加重ConA 引起的小鼠肝損傷；清除腸

13、源性LPS和TLR4 缺失小鼠在ConA 處理后肝臟損傷較輕，并且肝內(nèi)T細(xì)胞浸潤明顯減輕，CD4+T細(xì)胞的活化和體內(nèi)Th1相關(guān)細(xì)胞因子水平明顯低于對照組，而對Th1相關(guān)細(xì)胞因子有拮抗作用的Th2 相關(guān)細(xì)胞因子IL-10有明顯升高。清除腸源性LPS和TLR4 缺失能夠上調(diào)Mcl-1的表達(dá)而下調(diào)Bax的表達(dá)，并能夠增強(qiáng)Erk1/2的磷酸化，從而減輕ConA 引起的肝細(xì)胞凋亡，穿孔素/顆粒酶B 途徑可能參與了TLR4 缺失對肝細(xì)胞凋亡的保護(hù)作