孤雌生殖鹵蟲卵母細胞中休眠卵發(fā)育相關(guān)基因的分離分析.pdf

1、鹵蟲(Artemia)，也叫鹽水豐年蝦(Brine Shrimp)，屬于節(jié)肢動物門(Arthropoda)、甲殼綱(Crustacea)、鰓足亞綱(Branchiopoda)、無甲目( Anostacea)、鹵蟲科(Artemidae)、鹵蟲屬(Ar temia)，廣泛分布于內(nèi)陸鹽湖中。鹵蟲是目前已知耐鹽范圍最寬的多細胞動物。鹵蟲的胚胎具有兩種發(fā)育方式：一種是卵生( oviparity)，產(chǎn)生休眠卵(diapause cyst)，此時胚

2、胎停滯在原腸胚時期，休眠胚胎被厚厚的外殼包被，具有極低的代謝活性和很強的抗逆性，只有經(jīng)歷特殊的環(huán)境條件才能繼續(xù)發(fā)育；另一種是卵胎生(ovoviviparity)，直接產(chǎn)生無節(jié)幼體(nauplius)或先產(chǎn)生有薄外殼包被的卵并發(fā)育成無節(jié)幼體。
　　 為了探索鹵蟲休眠生殖發(fā)育方式調(diào)節(jié)的分子機制，我們運用消減雜交方法從鹵蟲(Artemia parthenogenetica，尕海湖)的將要經(jīng)歷休眠生殖方式的卵母細胞中克隆了大量基因的cD

3、NA.主要研究結(jié)果可以分為以下三部分：1)、為了開發(fā)全長cDNA消減雜交技術(shù)，我們首先改進了一種基于PCR的雙鏈cDNA合成方法，使合成的雙鏈cDNA中全長cDNA的比例增加，同時系統(tǒng)分析了PCR抑制性作用(PCR-suppression effect，PS-effect)的各影響因素，并利用PS-effect對小分子抑制作用更強的特點選擇性的富集雙鏈cDNA中大分子；2)、開發(fā)了雙鏈特異性DNA酶介導(dǎo)的cDNA均一化消減雜交(Dupl

4、ex-specific nuclease-mediated normalization andsubtractive hybridization，DNSH)，模型實驗表明該方法能夠使只占mRNA總含量0.0001％的差異表達的基因能夠被有效富集，并且能夠得到其全長cDNA；3)、運用DNSH，使將要卵胎生的鹵蟲卵母細胞去消減將要卵生的卵母細胞，分離并分析了將要產(chǎn)休眠卵鹵蟲側(cè)囊中卵母細胞的692個cDNA克隆，其中有323個與GenBan

5、k上已有的序列具有相似性。這692個cDNA共組裝成600個cDNA重疊群(contig)，其中單一的(singleton)有529，占了大部分。我們選擇了其中44個功能各異的基因(來源于56個克隆)進行熒光定量PCR分析，它們之間的mRNA水平差異最大達到約15，000倍。這其中，11個基因(21個克隆)的表達量在將產(chǎn)休眠卵的鹵蟲卵母細胞中顯著性上調(diào)(p<0.05)，另有7個基因(9個克隆)的表達量顯著性下調(diào)(p<0.05).由此表明