低血磷性佝僂病的分子遺傳學(xué)研究.pdf

1、背景：低血磷性佝僂病(hypophosphatemic rickets)是一組以腎臟排磷增多引起低磷血癥為特征的骨骼礦化障礙性疾病。該病主要臨床表現(xiàn)為骨骼畸形、身材矮小、牙齒異常（如牙周膿腫等）及骨痛等，是一種致殘、致畸率很高的疾病，給社會(huì)和家庭帶來(lái)很大的負(fù)擔(dān)。目前已經(jīng)明確的低血磷性佝僂病的致病基因有以下幾種:1.PHEX(Phosphate regμl ating gene with homologies to endopeptida

2、ses on the Xchromosome，X染色體上內(nèi)肽酶同源的磷調(diào)節(jié)基因)突變引起X連鎖顯性遺傳性低血磷性佝僂病(XLH);2.FGF23（fibroblast growth factor，成纖維生長(zhǎng)因子23）突變引起常染色體顯性遺傳性低血磷性佝僂病(ADHR);3.DMP1(dentin matrix protein1，牙基質(zhì)蛋白1)突變引起常染色體隱性遺傳性低血磷性佝僂病1型(ARHR1);4.ENPP1(ectonucleo

3、tide pyrophosphatase/phosphodiesterase1，核苷酸外焦磷酸酶/磷酸二脂酶1)突變引起常染色體隱性遺傳性低血磷性佝僂病2型(ARHR2);5.FAM20C（family with sequence similarity20，member C，序列相似家族成員20）突變引起常染色體隱性遺傳性低血磷性佝僂病3型(ARHR3);6.SLC34A3（solute carrier family34，member3

4、，鈉磷共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Ⅱ型溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)家族34）突變引起常染色體隱性遺傳性低血磷高尿鈣性佝僂病(HHRH)。其中XLH是低血磷性佝僂病最常見的類型。
　　由于該病臨床表現(xiàn)多樣，嚴(yán)重程度不一，給診斷帶來(lái)很大困難。盡早地明確分子診斷對(duì)于臨床診治、了解疾病預(yù)后及產(chǎn)前咨詢至關(guān)重要。由于低血磷性佝僂病的致病基因有多種，針對(duì)多個(gè)基因進(jìn)行傳統(tǒng)的Sanger測(cè)序，往往耗時(shí)費(fèi)力，高成本低效率。本課題組既往研究顯示，低血磷性佝僂病患者突變檢出率為25.8％-4

5、3.0％，低于國(guó)外報(bào)道。由于二代測(cè)序技術(shù)具有針對(duì)性強(qiáng)、費(fèi)用低、效率高等特點(diǎn)，采用二代高通量測(cè)序?qū)Φ脱仔载E病患者進(jìn)行遺傳學(xué)研究對(duì)于早期明確分子診斷及提高突變的檢出率顯得尤為重要?？偨Y(jié)本課題組XLH患者PHEX基因突變特點(diǎn)，不僅為中國(guó)人群XLH患者的分子診斷提供理論依據(jù)，同時(shí)也豐富了世界低血磷性佝僂病遺傳學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)。
　　目的：
　　1.分析和總結(jié)XLH患者的臨床特點(diǎn)。
　　2.篩查和檢測(cè)低血磷性佝僂病患者的致病基因。<

6、br>　　3.總結(jié)XLH患者PHEX基因突變特點(diǎn)及分布規(guī)律。
　　4.分析和總結(jié)ARHR2患者的臨床特點(diǎn)。
　　對(duì)象和方法：
　　1.研究對(duì)象:(1)2013.6-2015.4北京協(xié)和醫(yī)院收治的89例低血磷性佝僂病患者及相關(guān)家系成員;(2)傳統(tǒng)Sanger測(cè)序未檢出致病基因突變的83例低血磷性佝僂病患者。
　　2.研究方法:
　　(1)總結(jié)基因確診的XLH患者的臨床特點(diǎn);
　　(2) Sanger測(cè)序

7、檢測(cè)致病基因突變:針對(duì)基因（PHEX、FGF23、DMP1、ENPP1及SLC34A3）進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序，未報(bào)道的突變位點(diǎn)均在50例健康志愿者中進(jìn)行驗(yàn)證;
　　(3)二代測(cè)序及可疑致病突變的驗(yàn)證:對(duì)本研究及本課題組以往研究經(jīng)Sanger測(cè)序未檢出致病基因突變的低血磷性佝僂病患者進(jìn)行目標(biāo)區(qū)域捕獲結(jié)合二代測(cè)序;檢出的可疑致病突變，通過Sanger測(cè)序及MLPA方法(multiplexligation-dependent probe

8、 amplification，多重連接探針擴(kuò)增技術(shù))進(jìn)行驗(yàn)證;
　　(4)表型和基因型相關(guān)性研究:選取基因確診的XLH患者，根據(jù)不同的突變類型及突變位置，對(duì)表型與基因型的相關(guān)性進(jìn)行探討;
　　(5)PHEX基因突變特點(diǎn)總結(jié):總結(jié)本研究及本課題組以往研究確診的XLH患者PHEX基因突變類型及分布區(qū)域，探討有無(wú)熱點(diǎn)突變;
　　(6)總結(jié)ARHR2患者的臨床特點(diǎn)及ENPP1基因突變分析。
　　結(jié)果：
　　1.XL

9、H患者的臨床特點(diǎn)及PHFX基因突變分析
　　(1)對(duì)76例基因確診且臨床資料完整的XLH患者進(jìn)行臨床資料的總結(jié)和分析。所有患者均為幼年發(fā)病，發(fā)病年齡中位數(shù)為18m，開始中性磷治療年齡中位數(shù)為4.75歲。57例(75％)患者存在下肢膝內(nèi)翻畸形。44例(64.7％)患者存在口腔疾患。大多數(shù)患者存在身材矮小，其中成年女性終身高平均值為140.9±8.2cm，成年男性終身高平均值為150.3±9.3cm。生化檢查表現(xiàn)為低磷血癥、高尿磷、T

10、mP/GFR降低、血堿性磷酸酶(ALP)及FGF23水平升高。22例(28.9％)患者治療前全段甲狀旁腺激素(i-PTH)升高。
　　(2)本研究首先采用傳統(tǒng)Sanger測(cè)序的方法對(duì)89例臨床診斷為低血磷性佝僂病的患者進(jìn)行了包括PHEX、FGF23、DMP1、ENPP1和SLC34A3致病基因的突變檢測(cè)，共檢出PHF基因突變70例，未發(fā)現(xiàn)其他致病基因突變。PHFX基因總體突變檢出率為78.7％，有家族史的患者檢出率為93.6％，散

11、發(fā)性患者檢出率為61.9％。所發(fā)現(xiàn)的PHEX基因突變中，26種是國(guó)內(nèi)外尚未報(bào)道的突變。
　　(3)對(duì)于本研究及本課題組以往研究經(jīng)傳統(tǒng)Sanger測(cè)序未檢出致病基因突變的83例低血磷性佝僂病患者，采用目標(biāo)區(qū)域捕獲結(jié)合二代測(cè)序的方法檢出并驗(yàn)證了PHEX基因突變50例。二代測(cè)序檢出的敏感性為98.5％，特異性為86.7％。50例PHEX基因突變中，其中剪切位點(diǎn)突變12例，無(wú)義突變6例，微小缺失突變4例，微小插入突變4例，錯(cuò)義突變3例及大

12、片段缺失/復(fù)制21例。
　　(4)對(duì)本研究確診的76例XLH患者，根據(jù)不同的突變類型及突變位置進(jìn)行表型與基因型的相關(guān)性分析。選取性別比、有無(wú)家族史、發(fā)病年齡、骨骼畸形、牙齒疾患、ALP、PTH、1，25(OH)2D3及FGF23作為研究表型，基因型分為截短突變和非截短突變、以編碼氨基酸一半（375位氨基酸）為界的N端和C端突變兩種。本研究的結(jié)果顯示，76例XLH患者所選取的表型與基因型之間無(wú)明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性。
　　(5)本

13、研究匯總了課題組檢出的212例PHEX基因突變，PHEX基因突變檢出率為86.9％。通過采用二代測(cè)序，突變檢出率由66.0％升至86.5％。無(wú)義突變是最常見的PHEX基因突變類型。Exon18是PHE基因發(fā)生突變頻率最高的區(qū)域。
　　2.ARHR2患者的臨床特點(diǎn)及突變分析3例ARHR2患者均為幼年起病。與XLH患者不同的是，下肢膝外翻畸形多見、骨骼畸形及身材矮小程度相對(duì)較輕、高腭弓可能是ARHR2患者的特征性表現(xiàn)。二代測(cè)序檢出并經(jīng)

14、Sanger測(cè)序驗(yàn)證，2例患者均為ENPP1基因的復(fù)合雜合突變，1例患者為純和錯(cuò)義突變。
　　結(jié)論：
　　1.通過較大樣本量的研究，提出了中國(guó)人群XLH患者具有典型的臨床特征;
　　2.二代測(cè)序明顯提高了低血磷性佝僂病患者致病基因突變的檢出率，是對(duì)Sanger測(cè)序的重要補(bǔ)充;
　　3.通過匯總本課題組檢出的PHEX基因突變，發(fā)現(xiàn)無(wú)義突變是最常見的突變類型，Exon18是發(fā)生突變頻率最高的區(qū)域;
　　4.首次