甲基化作用調(diào)節(jié)miR-200b表達(dá)及對胃腺癌細(xì)胞增殖、侵襲能力的影響.pdf

1、目的：基因異常甲基化在多種疾病發(fā)生發(fā)展機(jī)制中有著重要的作用。本研究旨在探討 miR-200b發(fā)生甲基化程度不同及其表達(dá)量的差異對于胃癌細(xì)胞MGC-803、BGC-823增殖、侵襲、凋亡及對上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化作用的影響。
　　方法：本研究以正常人胃粘膜上皮細(xì)胞（GES-1）和胃癌細(xì)胞（MGC-803、BGC-823）為研究對象，miR-200b為研究指標(biāo)。首先提取正常未處理人正常胃粘膜上皮細(xì)胞GES-1及胃癌MGC-803、BGC-823

2、細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄之后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（RT-PCR）法檢測 miR-200b在三種細(xì)胞中表達(dá)的差別，而miR-200b啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平通過亞硫酸氫鈉修飾的PCR（BSP）法進(jìn)行檢測。其次，對MGC-803、BGC-823細(xì)胞進(jìn)行不同濃度和不同時(shí)間點(diǎn)的去甲基化處理，即使用濃度為2.5、5.0、7.5、10μM的5氮雜胞苷（5’-Aza-CdR）處理細(xì)胞，每24h換液一次作用72小時(shí)后，用RT-PCR法檢測miR-200b的表

3、達(dá)量變化， BSP法檢測miR-200b啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平的差異。根據(jù)表達(dá)量的差異及甲基化的程度選擇合適的藥物處理濃度。最后，使用最合適的藥物濃度（10μM）作用MGC-803、BGC-823細(xì)胞72h， transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力，流式細(xì)胞計(jì)術(shù)檢測細(xì)胞周期及凋亡的情況。Western Blot檢測受miR-200b表達(dá)量差異影響的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)指標(biāo)的變化。
　　結(jié)果：正常胃粘膜上皮細(xì)胞（GES-1）中mi

4、R-200b的表達(dá)量較高于胃癌細(xì)胞 MGC-803、BGC-823，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而miR-200b啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平則與之相反， MGC-803、BGC-823細(xì)胞系均較高于GES-1，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。選用不同濃度5’-Aza-CdR藥物處理細(xì)胞，兩種胃癌細(xì)胞系 miR-200b的表達(dá)量有隨著藥物濃度逐漸升高的趨勢，而濃度為10μM時(shí)miR-200b啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平較空白對照組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)

5、意義（P＜0.05）。Transwell實(shí)驗(yàn)表明，處理組的胃癌細(xì)胞其侵襲能力較對照組明顯減弱（P＜0.05）。流式細(xì)胞術(shù)表明實(shí)驗(yàn)組較對照組細(xì)胞周期進(jìn)展減慢，主要停留在G1期而S期細(xì)胞數(shù)相對減少（P＜0.01）。與對照組相比實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞晚期凋亡數(shù)量稍稍增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Western Blot實(shí)驗(yàn)表明，在表皮粘膜細(xì)胞中表達(dá)量較高的E-cadherin實(shí)驗(yàn)組較對照組表達(dá)量升高，而在間質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)量較高的N-cadheri

6、n,ZEB1,Slug,MMP9實(shí)驗(yàn)組較對照組表達(dá)量降低，即實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）程度降低。
　　結(jié)論：MiR-200b表達(dá)的下降可能在胃癌變過程中起到重要作用，其作用機(jī)制可能與miR-200b啟動(dòng)子區(qū)高度甲基化作用有關(guān)。miR-200b啟動(dòng)子區(qū)存在發(fā)生甲基化的位點(diǎn)并且甲基化程度的不同可以影響其表達(dá)量，而miR-200b表達(dá)量的差異又與胃癌細(xì)胞MGC-803、BGC-823增殖、侵襲能力密切相關(guān)。所以抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生