鮑曼不動桿菌耐藥特性及其與生物膜的相關(guān)性研究.pdf

1、鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumannii），是一種重要的條件致病菌，能夠在醫(yī)院各種醫(yī)療器械以及人體內(nèi)生存并引起多種感染性疾病，病死率高。在部隊傷員中的感染率也很高。近年來，鮑曼不動桿菌由于多重耐藥和泛耐藥越發(fā)普遍，被美國感染性疾病協(xié)會列為給醫(yī)療衛(wèi)生服務(wù)系統(tǒng)造成巨大挑戰(zhàn)的七大病原菌之一。在我國，鮑曼不動桿菌臨床分離率居前5名，耐藥形勢也日益嚴(yán)峻，給感染防治造成了極大的困難。密切監(jiān)測和分析鮑曼不動桿菌的耐藥性及遺傳多態(tài)性

2、，有助于有針對性地提出治療策略，提高治療效率。
　　除耐藥性強之外，鮑曼不動桿菌還是最常見的引起生物膜相關(guān)感染的病原菌之一。生物膜是細(xì)菌依附于載體表面形成的有細(xì)胞外基質(zhì)包被的細(xì)胞間相互協(xié)調(diào)的微生物膜性結(jié)構(gòu)。細(xì)菌形成生物膜后不僅耐藥能力極大提高，還能逃避機體免疫作用，長期存活并引起慢性感染，嚴(yán)重危害人類健康。生物膜是細(xì)菌在體內(nèi)外的主要存在形式，因此生物膜耐藥能力在實際中更為重要。已有研究表明它能夠達(dá)到細(xì)菌耐藥能力的10-1000倍，

3、極大地提高了治療難度。生物膜和耐藥是細(xì)菌的兩大重要生存能力，研究二者之間的關(guān)系以及生物膜耐藥能力的強度和影響因素，對深入理解細(xì)菌生物膜感染機制，尋找有效的防治方法具有重要意義，也是有效防控細(xì)菌感染的重要科學(xué)問題。這些問題雖然已有部分相關(guān)研究，但是至今還沒有定論，所以本課題主要開展了以下幾項研究。
　　第一部分首先分析了2010-2013年間從北京和廈門兩地臨床感染患者樣本收集的272株鮑曼不動桿菌的耐藥能力和遺傳多態(tài)性。從菌株對指

4、定的九大類21種抗生素的耐藥率看，耐藥問題非常突出：對頭孢類抗生素耐藥率最高（98.2％），其次是青霉素類（90.8%）、四環(huán)素類（68.4%）、氟喹諾酮類（66.9%）、青霉素+β-內(nèi)酰胺酶抑制劑類（65.4%）、氨基糖苷類（62.1%）、碳青霉烯類（59.9%）和葉酸代謝途徑抑制劑類（59.9%），對脂肽類耐藥率最低（3.7%）。多重耐藥和泛耐藥率高達(dá)72.4%。北京地區(qū)來源的菌株對除左氧氟沙星和多粘菌素B之外的全部抗生素耐藥率均顯

5、著高于從廈門分離的菌株。
　　從PFGE分子分型看，菌株遺傳多態(tài)性高，但八個優(yōu)勢流行簇均由多重耐藥菌和泛耐藥菌組成，有的已經(jīng)在北京和廈門兩地流行。分析發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢流行簇對阿米卡星、妥布霉素、米諾環(huán)素、左氧氟沙星、哌拉西林/他唑巴坦五種抗生素中的一種或幾種相對耐藥性低，提示可以更加有針對性地選擇抗生素治療。MLST分析發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢ST型中大多為多重耐藥和泛耐藥菌。發(fā)現(xiàn)了53個新的ST型，其中絕大多數(shù)為非多重耐藥菌，說明非多重耐藥菌變異率高。

6、
　　第二部分評價全部菌株的生物膜形成能力，比較生物膜形成前后耐藥能力變化，分析細(xì)菌耐藥能力、生物膜形成能力與生物膜耐藥能力三者之間的關(guān)系。使用結(jié)晶紫染色法分析所有菌株的生物膜形成能力，并通過共聚焦激光掃描顯微鏡法驗證。菌株的生物膜形成能力差異較大，OD550在0.078±0.003到2.556±0.137之間。其中249株菌（91%）能夠形成生物膜，63株（23%）生物膜形成能力強于ATCC19606。比較生物膜形成能力不同的2

7、2株菌的生長曲線，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌之間生長率沒有顯著差異。所以生物膜形成能力的差異不是由于細(xì)菌生長率差異。分析細(xì)菌耐藥能力與生物膜形成能力的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)二者之間存在負(fù)相關(guān)，即耐藥性強的菌株形成生物膜能力弱，而敏感菌往往能夠形成更強的生物膜。這初步說明鮑曼不動桿菌在形成生物膜和產(chǎn)生耐藥這兩大生存能力上存在互補。
　　隨后了解鮑曼不動桿菌形成生物膜后耐藥能力的變化。利用系統(tǒng)抽樣法，按照生物膜形成能力抽取31株菌，定量檢測菌株對頭孢噻肟、亞胺培南

8、、環(huán)丙沙星三種抗生素最低抑菌濃度（MIC）和最低生物膜清除濃度（MBEC）。發(fā)現(xiàn)細(xì)菌在形成生物膜后對不同抗生素的耐藥能力增長的幅度不同，對頭孢噻肟，MIC為0.5-1,024μg/mL，MBEC為256-524,288μg/mL，增幅為8-2,048倍。對亞胺培南，MIC為0.25-128μg/mL，MBEC為8-4,096μg/mL，增幅為32-512倍。對環(huán)丙沙星，MIC在0.25-256μg/mL，MBEC為8-8,192μg/m

9、L，增幅為16-512倍。將增幅與菌株的生物膜形成能力對比分析，發(fā)現(xiàn)二者之間無顯著相關(guān)性。而對每一種抗生素而言，生物膜耐藥能力與細(xì)菌耐藥能力正相關(guān)，意味著對于多重耐藥菌和泛耐藥菌來說，盡管形成的生物膜往往很弱，然而一旦形成，還是能夠極大地提高耐藥能力，使得抗感染治療的難度大大增加。
　　在第三部分，針對上述發(fā)現(xiàn)的現(xiàn)象從生物膜形成相關(guān)基因、質(zhì)粒圖譜、CRISPR系統(tǒng)、持留菌和轉(zhuǎn)錄組分析五個方面對其中的機制進(jìn)行初步探討。首先對已報道的

10、7個鮑曼不動桿菌生物膜形成相關(guān)基因（bap、bfs、abaI、bfmR、bfmS、csuA、csuAB）攜帶情況進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)其中的3個基因在不同耐藥能力菌株中的分布有明顯規(guī)律。bap基因在耐藥性越強的菌株中陽性率越高，bfmR和bfmS則在耐藥性越強的菌株中陽性率越低。結(jié)合文獻(xiàn)調(diào)研，發(fā)現(xiàn)bap基因編碼的Bap蛋白能夠提高生物膜的耐藥性，這就能夠在一定程度上解釋即使耐藥菌只能形成少量的生物膜，耐藥能力還是能夠得到極大提升這一現(xiàn)象。bfm

11、R和bfmS的分布與我們發(fā)現(xiàn)的生物膜形成能力與細(xì)菌耐藥能力負(fù)相關(guān)一致，另外還有文獻(xiàn)指出bfmS基因同樣影響細(xì)菌對亞胺培南和環(huán)丙沙星的耐藥能力，這一發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步提示生物膜形成相關(guān)基因與細(xì)菌耐藥過程有關(guān)。
　　在全部菌株中有255株能夠檢出質(zhì)粒，數(shù)量為1-7個不等，大小在5.28-207.6kbp之間。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)耐藥性強的菌株往往攜帶更多的質(zhì)粒，但是未發(fā)現(xiàn)生物膜形成能力和質(zhì)粒攜帶情況的關(guān)系。盡管文獻(xiàn)報道質(zhì)粒同時參與細(xì)菌耐藥和生物膜的調(diào)

12、控，但是單從質(zhì)粒的攜帶情況看還不能解釋本研究中發(fā)現(xiàn)的生物膜形成能力與細(xì)菌耐藥能力負(fù)相關(guān)的現(xiàn)象，需要深入進(jìn)行序列分析。
　　CRISPR系統(tǒng)檢測發(fā)現(xiàn)272株菌中僅有14株具有完整的CRISPR結(jié)構(gòu)，還有一株發(fā)生大片段的替換。CRISPR系統(tǒng)陽性的菌株生物膜形成能力顯著強于陰性菌。而且cas1和cas3基因在生物膜中表達(dá)上調(diào)，提示CRISPR系統(tǒng)有可能在生物膜中活躍。因為生物膜結(jié)構(gòu)的物質(zhì)交流通道有利于基因橫向轉(zhuǎn)移，所以CRISPR在生

13、物膜中對耐藥的調(diào)控作用可能比在游離菌中更強。
　　選擇涵蓋了耐藥敏感、生物膜形成能力最強最弱、生物膜耐藥增幅最大最小、生物膜耐藥能力最強最弱幾個特點的7株菌進(jìn)行持留菌比例分析，發(fā)現(xiàn)鮑曼不動桿菌生物膜中持留菌的比例在0.0001%-0.01%之間。耐藥性強的菌株生物膜中持留菌比例略高于敏感菌生物膜，這能夠解釋即使耐藥菌形成的生物膜稀疏斑駁，但是耐藥增幅不低于敏感菌這一現(xiàn)象。
　　選擇對亞胺培南耐藥和敏感的菌株各一株，對它們在游

14、離菌、生物膜、亞胺培南刺激下的游離菌和亞胺培南刺激下形成的生物膜四個狀態(tài)下進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌在抗生素刺激和形成生物膜的過程中有大量物質(zhì)代謝發(fā)生變化，而且基因突變率提高，除此之外，鞭毛組裝、ABC轉(zhuǎn)運系統(tǒng)、I型和II型分泌系統(tǒng)通路基因都在這些過程中發(fā)生表達(dá)變化，說明它們都同時在鮑曼不動桿菌生物膜的形成與耐藥過程中發(fā)揮作用。
　　綜上所述，本研究提出，鮑曼不動桿菌多重耐藥和泛耐藥率高，遺傳多態(tài)性高，優(yōu)勢流行簇對阿米卡星、妥布

15、霉素、米諾環(huán)素、左氧氟沙星、哌拉西林/他唑巴坦五種抗生素中的一種或幾種相對耐藥性低。生物膜形成能力和細(xì)菌耐藥能力存在負(fù)相關(guān)關(guān)系。生物膜耐藥能力與細(xì)菌耐藥能力正相關(guān)。形成生物膜后的耐藥增幅與生物膜強弱未見明顯關(guān)系，意味著很弱的生物膜也能夠極大地提高耐藥能力。這可能與bap基因和持留菌有關(guān)。CRISPR系統(tǒng)、鞭毛、ABC轉(zhuǎn)運系統(tǒng)、I型和 II型分泌系統(tǒng)等也有可能參與生物膜耐藥的調(diào)控。這些發(fā)現(xiàn)提示可以更加有針對性地選擇抗生素治療，而且加強了對