體外誘導(dǎo)鮑曼不動桿菌突變耐藥與主動外排機(jī)制的相關(guān)性研究.pdf

1、前言：
　　 鮑曼不動桿菌是一種革蘭氏陰性非發(fā)酵菌,廣泛分布于自然界及人體皮膚機(jī)體免疫力下降時可引起嚴(yán)重感染,如呼吸相關(guān)性肺炎(VAP)、敗血癥、泌尿系感染、腦膜炎等,故成為院內(nèi)感染的重要病原體。在過去十年,隨著現(xiàn)代先進(jìn)診療技術(shù)的丌展,抗生素和免疫制劑的臨床廣泛使用,鮑曼不動桿菌形成單一耐藥到多重耐藥或全耐藥、低耐藥率到高耐藥率的發(fā)展趨勢,引起嚴(yán)重致死性院內(nèi)感染的主要病原菌,抵抗所有常用的革蘭陰性抗菌劑,致使臨床用藥陷入困境,已

2、成為一個重要的全球性問題。因此從誘導(dǎo)多重耐藥機(jī)制的研究入手尋求解決辦法成為一種必然趨勢?，F(xiàn)有研究表明主動外排機(jī)制是促使鮑曼不動桿菌耐藥的一個重要因素,adeB基因在介導(dǎo)鮑曼不動桿菌耐藥中發(fā)揮重要作用,這種編碼外排系統(tǒng)基因的高表達(dá)導(dǎo)致了鮑曼不動桿菌的高耐藥和多重耐藥,可致對氨基糖苷類、β-內(nèi)酰胺類、喹諾酮、四環(huán)素、氯霉素、紅霉素、溴乙錠等多種藥物耐藥。故本研究擬通過體外誘導(dǎo)鮑曼不動桿菌突變耐藥試驗(yàn),分析敏感菌株同其誘導(dǎo)耐藥菌株間adeB主

3、動外排編碼基因表達(dá)量的變化差異,驗(yàn)證主動外排機(jī)制在鮑曼不動桿菌突變耐藥中的意義。
　　 目的：
　　 了解阿米卡星、奈替米星和亞胺培南在體外分別單獨(dú)誘導(dǎo)鮑曼不動桿菌耐藥株的情況;同時分別比較敏感菌株與體外誘導(dǎo)突變穩(wěn)定耐藥菌株間主動外排系統(tǒng)adeB表達(dá)量的情況;并觀察外排泵抑制劑存在下對敏感菌株及穩(wěn)定突變耐藥菌株耐藥水平影響程度的差異,以探討鮑曼不動桿菌耐藥性變化與主動外排系統(tǒng)表達(dá)間的關(guān)系。
　　 實(shí)驗(yàn)材料和方法：

4、
　　 標(biāo)本來源于2009年1月至2010年12月中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床分離的血液或引流物,分別對阿米卡星、奈替米星和亞胺培南敏感的鮑曼不動桿菌(各有19、17和25株),均為非重復(fù)菌株(同一病人只收集一株菌)。采用微量肉湯稀釋法分別測定對阿米卡星、奈替米星和亞胺培南的最低抑菌濃度(MIC),同時分別用上述三種藥物進(jìn)行體外誘導(dǎo)耐藥試驗(yàn):并觀察敏感菌株和耐藥株在CCCP存在條件下MIC值的變化程度;予以實(shí)時熒光定量ORT-P

5、CR方法測定敏感菌株與誘導(dǎo)耐藥后外排泵編碼基因adeB表達(dá)量的差異。
　　 結(jié)果：
　　 篩選的分別對阿米卡星、奈替米星和亞胺培南敏感菌株分別為19、17和25株。由阿米卡星、奈替米星和亞胺培南各自進(jìn)行體外誘導(dǎo)耐藥產(chǎn)生的穩(wěn)定耐藥菌株分別有11、15和8株:全部敏感菌株和亞胺培南突變耐藥菌株在含CCCP的條件下MIC值最大降低2倍,呈外排表型陰性,而阿米卡星、奈替米星突變耐藥菌株在含CCCP的條件下分別有10、14株MIC

6、值降低4倍或4倍以上,呈明顯的外排作用;實(shí)時定量QRT-PCR方法結(jié)果顯示敏感菌株以及亞胺培南突變耐藥菌株的adeB外排泵編碼基因均陰性,而阿米卡星和奈替米星突變耐藥菌株分別有10和5株表達(dá)adeB基因。
　　 討論：
　　 鮑曼不動桿菌形成單一耐藥到多重耐藥或全耐藥、低耐藥率到高耐藥率的發(fā)展趨勢,已成為引起嚴(yán)重致死性院內(nèi)感染的主要病原菌,抵抗所有常用的革蘭陰性抗菌劑,已成為一個重要的臨床全球問題。
　　 結(jié)果顯

7、示,鮑曼不動桿菌菌株對不同抗生素的反應(yīng)是不同的,由于外排泵系統(tǒng)作用。對外排泵抑制劑CCCP與QRT-PCR法結(jié)果并不一樣,說明外排泵抑制劑并不能完全反映主動外排泵adeB的情況:耐藥菌株不僅存在AdeABC外排系統(tǒng),可能還存在其它外排泵機(jī)制的介導(dǎo),或還存在其他重要的耐藥機(jī)制,如ESBLs酶、外膜通透性的改變與丟失等,有待后期實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。
　　 長時間、不規(guī)范應(yīng)用低于正常殺菌劑量的抗生素容易誘導(dǎo)出細(xì)菌的耐藥性,也正是細(xì)菌耐藥最

8、常見的原因之一。本試驗(yàn)通過體外藥物誘導(dǎo)證實(shí)了鮑曼不動桿菌可在長期低劑量的接觸抗菌藥物后產(chǎn)生耐藥性變異,形成耐藥菌證明此點(diǎn)。因此,合理使用抗菌藥,加強(qiáng)對耐藥菌株的監(jiān)控檢測及治療,可減少或避免耐藥株的傳播及暴發(fā)流行,也是預(yù)防及減少醫(yī)院條件致病菌感染及耐藥性形成傳播的重要風(fēng)險(xiǎn)管理對策。
　　 結(jié)論：
　　 本試驗(yàn)通過體外藥物誘導(dǎo)試驗(yàn)證實(shí)了敏感的鮑曼不動桿菌可在長期低劑量的接觸抗菌藥物后產(chǎn)生耐藥性變異,誘導(dǎo)耐藥過程中除了主動外排