甲氧滴滴涕及其代謝物對(duì)人胎盤及JEG-3細(xì)胞3β羥基類固醇脫氫酶1及CYP19A1的影響.pdf

1、甲氧滴滴涕(MXC)是一種殺蟲劑，目前已經(jīng)被歸類為一種弱性雌激素。MXC的化學(xué)結(jié)構(gòu)與DDT類似，現(xiàn)在MXC漸漸取代DDT成為常用的殺蟲劑，因?yàn)樗亩拘暂^DDT小，在環(huán)境中的存留時(shí)間也較DDT短。值得注意的是，MXC的主要代謝產(chǎn)物2，2-二(4-羥基苯基)-1，1，1-三氯乙烷(HPTE)能夠結(jié)合雌激素受體，其結(jié)合的半數(shù)有效濃度為750nM，在這個(gè)濃度下HPTE能夠取代雌二醇結(jié)合人類重組雌激素受體。我們以及其他實(shí)驗(yàn)組都已經(jīng)證實(shí)MXC和它的

2、代謝產(chǎn)物HPTE能夠直接抑制幾種類固醇生成酶的活性。MXC及HPTE能夠抑制睪丸部位的膽固醇側(cè)鏈裂解酶(CYP11A1)、3-羥基類固醇脫氫酶同系物2(3β-HSD2)、17β-羥基類固醇脫氫酶同系物3(17β-HSD3)和11β-羥基類固醇脫氫酶(11β-HSD)的活性。然而，MXC及它的代謝產(chǎn)物能否抑制入胎盤類固醇的合成？它的抑制機(jī)制又是怎樣的？這些都尚不清楚。
　　在本研究中，我們收集正常胎盤勻漿提取微粒體備用來(lái)檢測(cè)3β-H

3、SD1和CYP19A1的活性。首先在微粒體孕烯醇酮混合液中加入用不同濃度的MXC和HPTE（0.01μM、0.1μM、1μM、10μM和100μM），用放射免疫分析法來(lái)檢測(cè)催化產(chǎn)物孕酮的轉(zhuǎn)化率，計(jì)算出孕酮生成的速度，從而確定MXC及HPTE對(duì)3β-HSD1的活性的影響，根據(jù)作圖計(jì)算出MXC及HPTE對(duì)3β-HSD1的半抑制濃度值(IC50)。為了檢測(cè)MXC及HPTE對(duì)3β-HSD1的抑制模式，底物用不同濃度的孕烯醇酮（15.625nM、

4、31.25 nM、62.5 nM、125 nM、250 nM和500 nM）和0.2mM的NAD+，MXC及HPTE的濃度分別為0μM、5μM和10μM。為了檢測(cè)MXC及HPTE對(duì)3β-HSD1的抑制模式是否與NAD+有關(guān)，用0.2μM的孕烯醇酮和不同濃度的NAD+（12.5μM、25μM、50μM、100μM和200μM）以及MXC或HPTE（0μM、5μM和10μM）。催化產(chǎn)物孕酮的轉(zhuǎn)化率均用放射免疫分析法檢測(cè)。在微粒體和睪酮(10

5、0nM)混合液中加入不同濃度的MXC或HPTE（0.01μM、0.1μM、1μM、10μM和100μM），用放射免疫分析法檢測(cè)催化產(chǎn)物雌二醇的轉(zhuǎn)化率，然后計(jì)算出雌二醇生成的速度，從而確定MXC及HPTE對(duì)CYP19A1酶的活性的影響，并根據(jù)作圖計(jì)算出MXC及HPTE對(duì)CYP19A1的半抑制濃度值。為了檢測(cè)MXC及HPTE對(duì)CYP19A1的抑制模式，底物用不同濃度的睪酮（15.625 nM、31.25 nM、62.5 nM、125 nM、

6、250 nM和500 nM）、0.2mM的NADPH以及MXC或HPTE（0μM、100μM和200μM），催化產(chǎn)物中雌二醇的轉(zhuǎn)化率均用放射免疫分析法檢測(cè)。人絨毛膜癌細(xì)胞(JEG-3細(xì)胞)在不同濃度的MXC及HPTE(濃度為1μM、5μM、10μM、50μM和100μM)處理12h之后檢測(cè)培養(yǎng)基中孕酮的含量，確定MXC及HPTE對(duì)JEG-3細(xì)胞孕酮分泌的影響。JEG-3細(xì)胞在不同濃度的MXC及HPTE(濃度為1μM、5μM、10μM、5

7、0μM和100μM)處理的同時(shí)在培養(yǎng)基中加入脫氫表雄酮(DHEA)后培養(yǎng)12h，收集培養(yǎng)基，檢測(cè)培養(yǎng)基中雌二醇的水平，確定MXC及HPTE對(duì)JEG-3細(xì)胞在DHEA刺激下雌二醇分泌的影響。
　　研究發(fā)現(xiàn)，100μM的MXC和HPTE顯著抑制3β-HSD1的活性，MXC和HPTE抑制3β-HSD1酶的IC50分別為2.339±0.096μM和1.918±0.078μM。MXC和HPTE對(duì)人胎盤3β-HSD1酶的抑制模式都是競(jìng)爭(zhēng)性抑制

8、，使用不同濃度的輔因子NAD+時(shí)，雙倒數(shù)圖表分析顯示MXC和HPTE對(duì)3β-HSD1酶都是混合抑制。MXC對(duì)CYP19A1酶的活性沒有抑制作用，HPTE抑制CYP19A1酶的IC50為97.16μM。HPTE對(duì)CYP19A1酶的抑制模式是競(jìng)爭(zhēng)性抑制。MXC和HPTE對(duì)JEG-3細(xì)胞的生長(zhǎng)和發(fā)育沒有影響，MXC和HPTE在1μM時(shí)就能夠顯著降低孕酮的生成，在DHEA存在時(shí)，MXC和HPTE能夠顯著降低雌二醇的生成，其中具有抑制作用的最低M