甲氧滴滴涕及其代謝產物對人與大鼠3β-HSD、17β-HSD3抑制作用以及在大鼠體內的毒動學研究.pdf

1、目的：
　　 1．分析MXC及其代謝產物HPTE是否可以通過抑制3β-HSD與17β-HSD3而影響人與大鼠睪丸中雄激素的合成，并分析抑制作用的發(fā)生機制。
　　 2．建立同時測定大鼠血漿中MXC及其代謝產物HPTE濃度的HPLC方法。
　　 3．用建立的方法研究MXC及HPTE在大鼠體內的毒物代謝動力學。
　　 方法：
　　 （一）MXC和HPTE對人與大鼠睪丸中3β-HSD及17β-HSD3抑制

2、作用的研究實驗
　　 用CO2窒息法處死大鼠，取出睪丸，用玻璃勻漿器進行勻漿，制備微粒體，以Bio-Rad蛋白測定試劑盒測定總蛋白濃度。（人睪丸微粒體為成品）。
　　 1．在睪丸微粒體蛋白，NAD+，底物（[3H]-PREG和無標記PREG的混合物）等物質的配比濃度都不變的情況下加入不同濃度的MXC或HPTE進行反應以測定MXC或HPTE對3β-HSD的半數抑制濃度；在睪丸微粒體蛋白，NADPH，底物（[3H]-DION

3、E和無標記DIONE的混合物）等物質的配比濃度都不變的情況下加入不同濃度的MXC或HPTE進行反應以測定MXC或HPTE對17β-HSD3的半數抑制濃度。
　　 2．在睪丸微粒體蛋白，NAD+，MXC或HPTE等物質的配比濃度都不變的情況下加入不同濃度的底物（[3H]-PREG和無標記PREG的混合物）進行反應，以測定MXC或HPTE對3β-HSD的抑制模式；在睪丸微粒體蛋白，NADPH，MXC或HPTE等物質的配比濃度都不變的

4、情況下加入不同濃度的底物（[3H]-DIONE和無標記DIONE的混合物）進行反應，以測定MXC或HPTE對17β-HSD3的抑制模式。
　　 3．在睪丸微粒體蛋白，底物（[3H]-PREG和無標記PREG的混合物），MXC或HPTE等物質的配比濃度都不變的情況下加入不同濃度的NAD+進行反應以確定MXC或HPTE對3β-HSD的抑制模式是否是通過與NAD+競爭而實現；在睪丸微粒體蛋白，底物（[3H]-DIONE和無標記DION

5、E的混合物），MXC或HPTE等物質的配比濃度都不變的情況下加入不同濃度的NADPH進行反應以確定MXC或HPTE對17β-HSD3的抑制模式是否是通過與NADPH競爭而實現。
　　 到反應時間后，加入2ml冰乙醚終止反應，使用薄層色譜分離法分離類固醇，并用放射掃描儀測定放射性，用P4放射性計數與總計數（實驗開始時加入的[3H]-PREG的放射性計數）的比，來計算PREG轉化為P4的百分率；用T的放射性計數與總計數（實驗開始時加

6、入的[3H]-DIONE的放射性計數）的比來計算DIONE轉化為T的百分率。
　　 （二）建立同時測定大鼠血漿中MXC及其代謝產物HPTE濃度的HPLC方法
　　 高效液相色譜儀Agilent1100系列;色譜柱為AgilentZORBAXEclipseXDB-C18(4.6mmx150mm5μm)；流動相為A：H20，B：乙腈；二元梯度洗脫程序：0min時A：B(55:45)，6min時A：B(15:85)，8min時

7、A：B(55:45)，流速1.0ml·min-1;紫外檢測波長：240nm;柱溫：30℃。
　　 （三）MXC及HPTE在大鼠體內的毒物代謝動力學實驗
　　 取8只雄性SD大鼠，灌胃給藥（MXC，500mg·kg-1）染毒后，于不同時間點收集血液樣本。采用建立的HPLC法測定大鼠血漿中MXC和HPTE的含量，用DAS2.0程序處理數據，計算毒物代謝動力學參數。
　　 結果：
　　 （一）MXC和HPTE對

8、人與大鼠睪丸中3β-HSD及17β-HSD3抑制作用的研究實驗
　　 1．MXC和HPTE對人的3β-HSD有效抑制濃度為10nM。MXC抑制3β-HSD的IC50為53.21±15.52μM（人）和46.15±17.94μM（大鼠），HPTE對其抑制的IC50為8.29±2.49μM（人）和13.82±2.26μM（大鼠）。MXC達到100μM時，對人和大鼠的17β-HSD3活性沒有影響。而HPTE抑制17β-HSD3的IC5

9、0是12.1±1.9μM（人）和32.0±8.6μM（大鼠）。
　　 2．MXC和HPTE對3β-HSD的作用方式并非與底物孕烯醇酮相互競爭，而是與輔酶因子NAD+競爭。HPTE抑制17β-HSD3的作用方式不是與底物雄烯二酮競爭，而是與輔酶因子NADPH相互競爭。
　　 （二）同時測定大鼠血漿中MXC及其代謝產物HPTE濃度的HPLC方法
　　 血漿中MXC、HPTE和內標物氯硝西泮出峰干凈利落，峰形良好，分離

10、完全，無雜質峰干擾。MXC、HPTE和氯硝西泮留時間分別為8.19，4.26和3.34min.MXC在(0.06-12)mg·L-1范圍內線性關系良好(r=0.9998)，HPTE在(0.06-3)mg·L-1范圍內線性關系良好(r=0.9997)。血漿MXC及HPTE的定量下限均為0.06mg·L-1。平均相對回收率跟平均絕對回收率均在85％以上;日內精密度RSD小于5％，日間精密度RSD小于15％，可用于MXC及HPTE的毒動學研究

11、。
　　 （三）MXC及HPTE在大鼠體內的毒物代謝動力學實驗
　　 甲氧滴滴涕的毒動學參數：Cmax為(5.52±1.21)mg·L-1;t1/2α為(4.12±1.21)h:t1/2β為(22.54±6.31)h;AUC(0-t)為(65.97±17.94)mg·h-1·L-1;AUC(0-∞）為(69.06±18.61)mg·h-1·L-1;CL為(7.94±2.31)L·h-1·kg-1;V為(66.16±20.

12、21)L·kg-1。
　　 HPTE的毒動學參數：Cmax為(1.32±0.37)mg·L-1;t1/2。為(3.13±0.91)h：t1/2β為(31.12±10.91)h;AUC(0-t)為(14.69±2.99)mg·h·L-1:AUC(0-∞)為(17.23±3.66)mg·h-1·L-1;CL為(30.14±6.09)L·h-1·kg-1;V為(232.55±36.44)L·kg-1。
　　 結論：