Calbindin-D9k與甲氧滴滴涕抗小鼠著床的相關(guān)性研究.pdf

1、當(dāng)前，環(huán)境雌激素的危害問(wèn)題已引起人們極大的關(guān)注。許多研究證實(shí)，環(huán)境雌激素對(duì)動(dòng)物具有內(nèi)分泌干擾效應(yīng)，能明顯降低生殖功能[1,2]。
　　甲氧滴滴涕（MXC）是一種替代滴滴涕的有機(jī)氯殺蟲(chóng)劑，在體內(nèi)可被轉(zhuǎn)化為具有雌激素活性的代謝物[3]。被廣泛用于殺滅農(nóng)作物和室內(nèi)的害蟲(chóng)。與DDT相比，MXC具有毒性低、代謝快、在脂肪組織中不易蓄積等優(yōu)點(diǎn)[4]。然而研究表明，MXC對(duì)動(dòng)物的生育具有毒性作用，包括阻止胚胎著床[5,6,7]，但MXC抑制胚胎

2、著床的機(jī)制尚待深入研究。
　　鈣結(jié)合蛋白D9k（Calbindin-D9k）是一種分子量為9kD的鈣結(jié)合蛋白，屬于細(xì)胞內(nèi)的蛋白家族。子宮Calbindin-D9k因與細(xì)胞內(nèi)的鈣水平密切相關(guān)，認(rèn)為其可控制子宮肌層的活動(dòng)[8]。此外，有證據(jù)表明，在胚胎植入的早期階段必需有Calbindin-D9k的存在，它對(duì)胚胎的成功植入發(fā)揮至關(guān)重要的作用[9]。
　　研究發(fā)現(xiàn)，未成熟雌性大鼠體內(nèi)暴露環(huán)境雌激素，如MXC，可引起子宮Calbin

3、din-D9k的表達(dá)顯著上升，并呈劑量依賴關(guān)系，因此Calbindin-D9k可被用作檢測(cè)環(huán)境雌激素類化學(xué)物雌激素活性的生物標(biāo)志物，然而，有關(guān)MXC對(duì)胚胎著床期Calbindin-D9k表達(dá)的影響的研究十分缺乏。
　　本課題的目的是通過(guò)使用MXC染毒孕小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，探討MXC對(duì)孕小鼠子宮雌激素受體α亞型(ERα)、孕激素受體（PR）表達(dá)的影響以及對(duì)小鼠妊娠率及胚胎著床數(shù)的影響。同時(shí)，進(jìn)一步深入研究MXC染毒對(duì)孕小鼠子宮Ca

4、lbindin-D9kmRNA和蛋白表達(dá)的影響，揭示MXC抑制胚胎著床的分子機(jī)制。
　　本實(shí)驗(yàn)分為兩個(gè)部分。
　　第一部分：構(gòu)建MXC染毒孕小鼠模型，觀察MXC對(duì)胚胎著床及子宮ERα、PR表達(dá)的影響。
　　八十只交配成功的雌小鼠被隨機(jī)分配到4個(gè)組，每組20只。其中3個(gè)MXC處理組小鼠從孕1d（發(fā)現(xiàn)陰栓定為孕0d）起給予MXC灌胃染毒，每天1次，連續(xù)3d，劑量分別為低劑量組(100mg/kg),中劑量組(200mg/kg

5、),高劑量組(400mg/kg),MXC溶解在芝麻油中給藥。對(duì)照組小鼠只灌芝麻油溶劑。至孕5d處死孕鼠，迅速分離出子宮并觀察各組小鼠妊娠率及胚胎著床數(shù)。采用RT-PCR檢測(cè)子宮ERα、PRmRNA表達(dá)，免疫組織化學(xué)與圖像分析技術(shù)檢測(cè)子宮ERα、PR蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：①孕小鼠經(jīng)MXC灌胃3d后，高、中劑量MXC組孕小鼠的妊娠率與對(duì)照組相比顯著降低(P<0.05)，低劑量MXC組孕小鼠的妊娠率與對(duì)照組相比降低無(wú)明顯差異；②高、中劑

6、量MXC組孕小鼠平均胚胎著床數(shù)與對(duì)照組相比顯著降低(P<0.01)，然而，低劑量組孕小鼠胚胎著床數(shù)雖然有所降低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。③隨著MXC染毒劑量的增加，孕小鼠子宮ERαmRNA與蛋白的表達(dá)量相應(yīng)增加，高、中劑量組ERαmRNA與蛋白的表達(dá)與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；④高、中劑量組孕小鼠子宮PRmRNA的表達(dá)較對(duì)照組顯著降低(P<0.05)，低劑量組PRmRNA的表達(dá)未見(jiàn)明顯變化，PR蛋白表達(dá)的變化與PRmRNA

7、的變化一致。
　　第二部分：MXC對(duì)孕早期小鼠子宮Calbindin-D9k基因表達(dá)的影響
　　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物染毒模型構(gòu)建同實(shí)驗(yàn)一。采用RT-PCR檢測(cè)Calbindin-D9kmRNA表達(dá)，Westernblot和免疫組化染色法檢測(cè)Calbindin-D9k蛋白表達(dá)。結(jié)果：當(dāng)孕鼠暴露MXC3d后，高、中劑量組Calbindin-D9kmRNA的表達(dá)量與對(duì)照組相比顯著降低(P<0.05)，然而，低劑量組Calbindin-D9km

8、RNA的表達(dá)與對(duì)照組相比降低不明顯(P>0.05)。Calbindin-D9k蛋白在孕5d主要表達(dá)在子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和腺上皮細(xì)胞。與mRNA的表達(dá)水平相應(yīng)，高、中劑量組Calbindin-D9k蛋白的表達(dá)量與對(duì)照組相比顯著降低(P<0.05)，而低劑量組與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異(P>0.05)。
　　結(jié)論：綜合以上結(jié)果，我們得出如下結(jié)論：
　　①M(fèi)XC染毒可明顯降低孕小鼠的妊娠率及胚胎著床數(shù)，抑制胚胎著床作用與MXC染毒劑量呈

9、正相關(guān)性。
　?、贛XC通過(guò)其弱雌激素活性和拮抗孕激素作用，上調(diào)孕小鼠子宮ERαmRNA及蛋白表達(dá)，同時(shí)下調(diào)PRmRNA及蛋白表達(dá)，說(shuō)明MXC可干擾孕小鼠體內(nèi)雌、孕激素正常環(huán)境，抑制胚胎著床。
　?、叟咛ブ苍缙贑albindin-D9k參與調(diào)節(jié)著床點(diǎn)鈣的利用及控制子宮肌層的活動(dòng)，對(duì)胚胎穩(wěn)定著床發(fā)揮重要作用。MXC染毒降低著床期孕小鼠子宮Calbindin-D9kmRNA及蛋白表達(dá)，其下調(diào)水平與MXC染毒劑量呈正相關(guān)性。