鹽橋?qū)lostridium absonum 7α-羥基類固醇脫氫酶熱穩(wěn)定性影響的實(shí)驗(yàn)及理論研究.pdf

1、鹽橋?qū)lostridiumabsonum7α羥基類固醇脫氫酶熱穩(wěn)定性影響的實(shí)驗(yàn)及理論研究重慶大學(xué)碩士學(xué)位論文（學(xué)術(shù)學(xué)位）學(xué)生姓名：何新琰指導(dǎo)教師：祝連彩實(shí)驗(yàn)師專業(yè)：藥學(xué)學(xué)科門類：理學(xué)重慶大學(xué)生物工程學(xué)院二〇一六年六月重慶大學(xué)碩士學(xué)位論文中文摘要I摘要Clostridiumabsonum7α羥基類固醇脫氫酶（Clostridiumabsonum7αHydroxysteroiddehydrogenase，CA7ɑHSDH）參與介導(dǎo)TCDC

2、A轉(zhuǎn)化成TUDCA的過程，而TUDCA是我國名貴動(dòng)物藥材熊膽的特有和主要活性成分，因而該酶在生物轉(zhuǎn)化和工業(yè)生產(chǎn)上具有較大的應(yīng)用前景及經(jīng)濟(jì)價(jià)值，更在保護(hù)黑熊及維護(hù)生態(tài)平衡方面具重大意義。本實(shí)驗(yàn)室前期研究已經(jīng)解析了CA7αHSDH的晶體結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示其分子中含有大量的鹽橋，鹽橋?qū)Φ鞍踪|(zhì)的熱穩(wěn)定性是否有貢獻(xiàn)這一點(diǎn)在許多學(xué)者看來還有待商榷，在許多對(duì)與酶熱穩(wěn)定性相關(guān)的因素的研究中表明鹽橋?qū)Φ鞍踪|(zhì)耐熱性的作用表現(xiàn)不一，因此研究鹽橋?qū)A7αHSDH

3、熱穩(wěn)定性的影響是提高該酶熱穩(wěn)定性的重要前提。本課題以CA7αHSDH為研究對(duì)象，利用MD模擬篩選出較為穩(wěn)定的鹽橋，對(duì)其進(jìn)行了移除，檢測(cè)酶的熱穩(wěn)定性變化，觀察鹽橋?qū)A7αHSDH熱穩(wěn)定性的作用。本研究主要包括實(shí)驗(yàn)研究和理論研究?jī)蓚€(gè)部分：從定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)角度出發(fā)討論了鹽橋?qū)?αHSDH熱穩(wěn)定性的影響，并從分子動(dòng)力學(xué)模擬的角度對(duì)原因進(jìn)行了理論上的初步探究。（1）通過分析在300K環(huán)境下的MD模擬軌跡文件，確定了4對(duì)可進(jìn)行鹽橋破壞設(shè)計(jì)的ON原子

4、距離波動(dòng)范圍始終保持在3.5之內(nèi)的穩(wěn)定鹽橋并通過定點(diǎn)突變將鹽橋破壞，野生型酶和突變酶純化表達(dá)后進(jìn)行熱穩(wěn)定性相關(guān)的酶學(xué)性質(zhì)對(duì)比分析。得到的4個(gè)突變酶中，D49N突變體失活，E24Q、D85N以及D206N的最適溫度均由野生型的35℃下降至25℃附近，并且45℃保溫2小時(shí)后WT仍具有20%左右的相對(duì)酶活，而同樣條件下各突變體均已失活。半衰期檢測(cè)顯示，15℃和25℃下各個(gè)酶t12變化不大，但在35℃時(shí)WT酶的t12為0.39h，各個(gè)突變酶卻有

5、不同程度的增加，45℃時(shí)野生酶t12為0.13h，各個(gè)突變酶已檢測(cè)不到半衰期。Tm值檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，突變型酶的Tm值均從WT的72℃下降至65℃左右。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示突變酶的熱穩(wěn)定性發(fā)生了下降。（2）利用Amber力場(chǎng)對(duì)野生型和四個(gè)虛擬突變的酶進(jìn)行300K、310K和320K條件下5ns的MD模擬。各個(gè)體系的蛋白主鏈RMSD值結(jié)果顯示只有320K下的D206N發(fā)生了明顯的大幅度升高。RMSF值結(jié)果顯示300K時(shí)除了D49N的主鏈蛋白柔性變化大