Clostridium absonum 7α-羥基類固醇脫氫酶輔酶結(jié)合區(qū)關(guān)鍵殘基的功能研究.pdf

1、羥基類固醇脫氫酶（Hydroxysteroiddehydrogenase，HSDH）在膽汁酸類物質(zhì)轉(zhuǎn)化、甾體激素轉(zhuǎn)化、膽固醇代謝、非甾體類醛、酮和醌羰基還原等過程中發(fā)揮著重要作用，同時(shí)，在工業(yè)生物催化方面也具有較大的應(yīng)用潛力。本文以Clostridiumabsonum7α-HSDH（CA7α-HSDH）為研究對(duì)象，利用基因工程手段對(duì)CA7α-HSDH的輔酶結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行改造，進(jìn)一步應(yīng)用分子動(dòng)力學(xué)模擬分析酶與輔酶的作用細(xì)節(jié)，闡明CA7α-H

2、SDH輔酶結(jié)合區(qū)關(guān)鍵殘基的功能。
　　主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下：
　?。?）在GST標(biāo)簽融合表達(dá)的基礎(chǔ)上，本文進(jìn)一步探索了CA7α-HSDH關(guān)于pTWIN1載體的表達(dá)，成功構(gòu)建了CA7α-HSDH/pTWIN1表達(dá)系統(tǒng)，獲取了有良好活性的CA7α-HSDH，該表達(dá)方式的構(gòu)建為降低CA7α-HSDH的獲取成本，推動(dòng)工業(yè)應(yīng)用提供了一定基礎(chǔ)。
　?。?）通過對(duì)三維結(jié)構(gòu)分析，運(yùn)用定點(diǎn)突變技術(shù)，對(duì)CA7α-HSDH的輔酶結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)

3、行改造，成功獲得了7個(gè)突變體T15A、R16A、R38A、R194A、R16A/R194A、R38A/R194A、T15A/R16A/R194A。酶促動(dòng)力學(xué)研究顯示，①成功獲得了活性提高的R16A和R194A突變體，相比于野生型酶活性分別提高1.8倍和4.8倍。二者催化常數(shù)（kcat）和米氏常數(shù)（Km）均增大，R16A的催化效率（kcat/Km）下降了16.2％，而R194A的催化效率（kcat/Km）增大3倍。②T15A、R16A/R

4、194A和T15A/R16A/R194A三個(gè)突變體同野生型酶相比，酶活性分別下降了26.8%、55.2%、75.9%。三者催化常數(shù)（kcat）降低，米氏常數(shù)（Km）增大，催化效率（kcat/Km）分別下降了81.8%、43.4%、84.6%。③R38A、R38A/R194A兩個(gè)突變體未檢測(cè)到活性，初步推測(cè)R38的作用較為關(guān)鍵。④從酶促動(dòng)力學(xué)參數(shù)發(fā)現(xiàn)，保持功能的突變體Km和單點(diǎn)突變體的kcat均增大，推測(cè)T15、R16、R194的作用體現(xiàn)

5、在酶與輔酶間親和力和催化速度方面，相應(yīng)的，T15和R194分別在維持親和力和轉(zhuǎn)化底物速度方面有較為突出的貢獻(xiàn)。
　?。?）運(yùn)用MD模擬技術(shù)，對(duì)上述突變體與輔酶作用的細(xì)節(jié)進(jìn)行了研究。①結(jié)合自由能計(jì)算結(jié)果顯示，與野生型相比，七個(gè)突變體與NADP+的結(jié)合自由能顯著上升，這與酶促動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)測(cè)得的結(jié)果——突變體酶對(duì)NADP+的親和力下降相符。②對(duì)R38A和R38A/R194A突變體分析發(fā)現(xiàn)，陽離子-π作用消失，表明突變體與輔酶的作用模式的改

6、變破壞了NADPH與酶的結(jié)合，是突變體失去活性的原因；T15A、R16A、R194A、R16A/R194A、T15A/R16A/R194A這五個(gè)突變體未影響R38與輔酶的陽離子-π作用，因而仍然保持生物功能，與酶活實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符，由此表明R38在CA7α-HSDH與輔酶II結(jié)合過程中具有關(guān)鍵作用。③將T15、R16、R194單點(diǎn)突變?yōu)楸彼岷?，小幅度減弱磷酸基團(tuán)周圍的正電量，T15、R16、R194與2位磷酸基團(tuán)的氫鍵作用消失，由此表明，

7、由T15、R16、R194介導(dǎo)的與磷酸基的氫鍵將直接影響酶與輔酶間親和力，且親和力具有一定的最適范圍，在該范圍內(nèi)，適當(dāng)?shù)臏p弱親和力有利于酶活、催化效率的提高；另外，將R194突變?yōu)楸彼岷?，R194與焦磷酸橋的氫鍵作用全部消失，導(dǎo)致焦磷酸橋柔性增大，處于反應(yīng)中心的煙酰胺環(huán)運(yùn)動(dòng)/解離容易，整體反應(yīng)速度加快，這與突變實(shí)驗(yàn)結(jié)果kcat值增加是相符的。④聯(lián)合突變體R16A/R194A和T15A/R16A/R194A中，逐步提高正電量的減少程度，