16106.睪丸酮叢毛單胞菌3β17β羥基類固醇脫氫酶的表達(dá)調(diào)控分析

1、分類號：——UDC：睪丸酮叢毛單胞菌3p／1713一羥基類固醇脫氫酶的表達(dá)調(diào)控分析AnalysisofExpressionalRegulationOf3p／17[；一hydroxysteroidDehydrogenaseGeneInComamonasTestosteroni學(xué)位授予單位及代碼：拯壹堡王盔堂(!Q!墾魚2學(xué)科專業(yè)名稱及代碼：生物醫(yī)堂工猩!Q璺墨!QQ2論文起止時(shí)間：20119—2012121』f，，’讒矸f‰瓣一一謄，，國

2、，t、一，。級導(dǎo)摘要甾體激素是環(huán)境中存在的一類重要污染物，甾體激素的生物型降解和降解基因的表達(dá)調(diào)控分析日漸受到科研工作者的重視。睪丸酮叢毛單胞菌是一種利用甾體激素作為碳源和能源的革蘭氏陰性細(xì)菌。本文利用酶聯(lián)吸附免疫實(shí)驗(yàn)、基因敲除技術(shù)、高效液相色譜、環(huán)化RTPCR技術(shù)、反向PCR技術(shù)、質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化技術(shù)等對睪丸酮叢毛單胞菌中313／17B羥基類固醇脫氫酶的誘導(dǎo)表達(dá)、功能進(jìn)行分析，以及轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、表達(dá)調(diào)控機(jī)理進(jìn)行研究。在培養(yǎng)基中分別加入等量的

3、17D一雌二醇、雌三醇、膽固醇、睪丸酮進(jìn)行睪丸酮叢毛單胞菌的培養(yǎng)，ELISA結(jié)果揭示313／1713HSD受甾體激素誘導(dǎo)，尤其睪丸酮對3[3／1713HSD誘導(dǎo)效應(yīng)顯著，高于無甾體激素添加表達(dá)量的45％。通過首次構(gòu)建313／1713HSD基因缺失突變菌株研究發(fā)現(xiàn)：313／1713HSD對膽固醇、睪丸酮的利用起重要作用，3[3／1713一HSD基因缺失突變菌株對膽固醇的降解功能喪失，對睪丸酮的利用效率降低95％以上；同時(shí)發(fā)現(xiàn)3p／17pH

4、SD對甾體激素作用靶點(diǎn)是C3上的羰基。利用環(huán)化RTPCR的方法研究發(fā)現(xiàn)313／1713HSD基因mRNA全長不唯一，但基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)基本集中在基因上游143bp的位置，可能與細(xì)菌自身的代謝機(jī)制相關(guān)。LysR轉(zhuǎn)錄調(diào)控家族是一類轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。采用質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化研究3p／17pHSD基因上游一個(gè)未知LysR蛋白對3p／1713HSD的轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控研究發(fā)現(xiàn)：在無外源激素誘導(dǎo)條件下，含有LysR基因的菌株比不含LysR基因的菌株313／1713HS