睪丸酮叢毛單胞菌中甾體激素降解酶的功能分析及應(yīng)用.pdf

1、近幾年來，激素污染問題越來越嚴(yán)重，污染物隨著食物鏈逐步傳遞給生物體，給大量的生物體帶來了嚴(yán)重的損害。甾體激素是當(dāng)今環(huán)境中存在的一類重要的污染物，甾體激素的生物型降解和降解基因的功能分析日漸受到人們廣泛的關(guān)注和重視。
　　睪丸酮叢毛單胞菌是一種利用甾體激素作為唯一碳源和能源的革蘭氏陰性菌。本文利用基因克隆技術(shù)、基因敲除技術(shù)、電轉(zhuǎn)化、酶聯(lián)吸附免疫實(shí)驗(yàn)、高效液相色譜等技術(shù)對(duì)睪丸酮叢毛單胞菌中SDR短鏈脫氫酶的克隆及誘導(dǎo)表達(dá)、功能分析，以

2、及具體基因片段的敲除進(jìn)行研究。采用PCR克隆得到SDR基因，構(gòu)建了該基因的原核表達(dá)體系pET-15b-SDR/E.coliBL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)并用His-Binding-resin純化柱進(jìn)行純化，免疫BALB/c小鼠，用獲得的高效價(jià)鼠源多克隆抗體，建立SDR酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法(ELISA)。最終表達(dá)的蛋白分子量約為30.6kDa，純化后濃度為8.7mg/mL，鼠源抗體效價(jià)為5×104。在不同的培養(yǎng)基中分別加入等濃度

3、的17β-雌二醇、雌三醇、膽固醇、睪丸酮進(jìn)行睪丸酮叢毛單胞菌的培養(yǎng)，ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示SDR受甾體激素誘導(dǎo)，尤其膽固醇對(duì)SDR誘導(dǎo)效應(yīng)顯著，高于無甾體激素添加的表達(dá)量。
　　利用基因敲除技術(shù)構(gòu)建SDR基因缺失突變菌株，利用高效液相色譜檢測(cè)被甾體激素誘導(dǎo)的野生型菌株和基因缺失突變菌株，研究發(fā)現(xiàn):SDR對(duì)膽固醇、睪丸酮的利用起重要作用，SDR基因缺失突變菌株對(duì)膽固醇的降解功能喪失，對(duì)睪丸酮的利用效率降低90％以上;
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