大鼠肝臟70％門靜脈分支高位結(jié)扎后功能、結(jié)構(gòu)及自噬水平變化的研究.pdf

1、[目的]
　　通過高位結(jié)扎大鼠70％門靜脈分支建立肝纖維化模型，研究肝臟功能、結(jié)構(gòu)及自噬相關(guān)蛋白表達的變化，發(fā)現(xiàn)大鼠肝纖維化模型建立的新方式，了解肝纖維化、肝組織代償性增生與細胞自噬的關(guān)系。
　　[方法]
　　1.把Wistar大鼠75只隨機分為3組:手術(shù)組30只、假手術(shù)組30只，正常對照組15只。手術(shù)組行70％門靜脈高位結(jié)扎術(shù)，假手術(shù)組行開腹、游離門靜脈、關(guān)腹術(shù)，對照組不做處理。手術(shù)組分別于術(shù)后3天、5天、7天、14

2、天、28天各取6只處死取肝臟及血液標本，假手術(shù)組分別于術(shù)后3天、5天、7天、14天、28天各取5只處死取肝臟及血液標本，空白對照組5只處死取肝臟及血液標本。
　　2.各組大鼠處死后，取血液標本檢測ALT、AST，取肝組織行Masson染色，進行肝臟組織肝纖維化程度半定量評分。
　　3.采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Realtime R-T quantitative Polymerase ChainReaction，Real

3、time R-T qPCR)檢測各組肝星狀細胞(HSC)激活相關(guān)基因總α-SMA的表達及各組自噬相關(guān)基因總BECN1（表達Beclin1）的表達。
　　4.采用蛋白印跡法(Western-Blotting，WB)檢測各組肝臟組織肝星狀細胞激活相關(guān)蛋白α-SMA的總體表達及自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3B等的總體表達情況。
　　5.統(tǒng)計學處理:用統(tǒng)計學軟件SPSS17.0統(tǒng)計分析，計量資料用均數(shù)±標準差(M±SD)，兩組間

4、比較采用t檢驗，組間差異比較用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　[結(jié)果]
　　1.各組大鼠一般狀態(tài)良好，手術(shù)組結(jié)扎側(cè)肝臟明顯萎縮，未結(jié)扎側(cè)肝臟代償性增大，隨著時間推移，更加明顯。肝臟與體重比相比結(jié)果:隨著結(jié)扎時間延長，結(jié)扎側(cè)逐漸減小(P＜0.05)，未結(jié)扎側(cè)逐漸增大(P＜0.05)，結(jié)扎側(cè)與未結(jié)扎側(cè)肝重比體重與假手術(shù)組和對照組無明顯差異(P＞0.05)，兩側(cè)肝臟總比重無變化。
　　2.大鼠70％門

5、靜脈分支高位結(jié)扎后，肝功能同對照組相比，轉(zhuǎn)氨酶有一過性升高(P＜0.01)，3天時血清中ALT、AST明顯升高，5天時逐漸恢復正常。假手術(shù)組轉(zhuǎn)氨酶有一過性升高(P＜0.05)，對照組無明顯異常(P＞0.05)。
　　3.肝臟組織行Masson染色，3天、5天各組無明顯變化，7天、14天、28天結(jié)扎側(cè)見纖維蛋白(P＜0.05)，28天最為明顯(P＜0.01);未結(jié)扎側(cè)呈代償性增生改變。假手術(shù)組、對照組無明顯變化(P＞0.05)。

6、r>　　4.Realtime RT-qPCR結(jié)果顯示，手術(shù)組結(jié)扎側(cè)α-SMA基因的表達量升高，隨著時間推移更加明顯(P＜0.05);未結(jié)扎側(cè)3天時一過性升高(P＜0.05)。手術(shù)組結(jié)扎側(cè)與未結(jié)扎側(cè)自噬相關(guān)基因Beclin1的表達量均有變化。3天時結(jié)扎側(cè)升高(P＜0.05)，未結(jié)扎側(cè)與對照組和假手術(shù)組相比較無差異(P＞0.05)，5天、7天、14天、28天未結(jié)扎側(cè)均高于結(jié)扎側(cè)，隨著時間推移更加明顯，結(jié)扎側(cè)該基因表達情況隨時間推移呈下降趨勢

7、，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。假手術(shù)組與對照組無明顯差異(P＞0.05)。
　　5.WB(Western-Blotting)檢測各組肝臟組織總α-SMA蛋白結(jié)扎側(cè)含量升高，并隨結(jié)扎時間延長有增高趨勢(P＜0.01)。自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3BⅡ/Ⅰ等總表達水平均有變化，3天時結(jié)扎側(cè)升高(P＜0.05)，未結(jié)扎側(cè)與對照組和假手術(shù)組相比較無差異(P＞0.05)，5天、7天、14天、28天未結(jié)扎側(cè)均高于結(jié)扎側(cè)，結(jié)扎側(cè)Be

8、clin1蛋白、LC3BⅡ/Ⅰ蛋白比值表達水平下調(diào)，隨著時間推移更加明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。假手術(shù)組與對照組無明顯差異(P＞0.05)。
　　[結(jié)論]
　　1.大鼠70％門靜脈分支高位結(jié)扎后，3天時轉(zhuǎn)氨酶升高，5天時轉(zhuǎn)氨酶恢復正常，可能與前期結(jié)扎側(cè)炎癥反應(yīng)、肝萎縮有關(guān)，引起轉(zhuǎn)氨酶一過性升高、肝功能異常，5天時及以后肝臟功能代償，肝功能恢復正常。
　　2.相對于對照組及假手術(shù)組大鼠，手術(shù)組結(jié)扎側(cè)肝臟組織出

9、現(xiàn)萎縮，7天、14天、28天結(jié)扎側(cè)肝臟組織出現(xiàn)明顯的纖維化，未結(jié)扎側(cè)肝組織肝細胞明顯增殖，整個實驗過程中，肝臟占體重總比值不變。
　　3.手術(shù)組結(jié)扎側(cè)α-SMAmRNA及蛋白的表達量呈升高趨勢，提示肝星狀細胞的激活逐漸增多，肝纖維化逐漸加重，未結(jié)扎側(cè)α-SMA3天時稍升高可能與肝組織淤血及代償性增生的過程中HSC代償增殖有關(guān)，并呈下降趨勢。手術(shù)組結(jié)扎側(cè)與未結(jié)扎側(cè)均出現(xiàn)自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3BⅡ/Ⅰ總表達量的變化，可能與