大鼠門靜脈高壓食管靜脈曲張模型中內(nèi)皮祖細(xì)胞的變化及意義.pdf

1、第一部分，門靜脈縮窄法門靜脈高壓大鼠模型的建立
　　目的:制作大鼠肝前性門靜脈高壓癥食管靜脈曲張模型及內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離、鑒定和培養(yǎng)。
　　方法:雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、對(duì)照組和模型組。模型組大鼠顯微鏡下游離,結(jié)扎并離斷左腎上腺靜脈,完全游離全長左腎靜脈并清除左腎周圍脂肪組織;游離門靜脈主干,將8-9號(hào)注射器針頭與門靜脈主干并行,結(jié)扎后抽出針頭形成門靜脈縮窄。對(duì)照組僅處理左腎上腺靜脈。假手術(shù)組僅開腹探查。2周、4周后剖殺

2、大鼠并測門靜脈壓力。留取肝臟、食管胃底組織,液氮凍存,另一部分石蠟包埋并切片HE染色。抽取門靜脈血,Ficoll分離單個(gè)核細(xì)胞,EGM-2培養(yǎng)液誘導(dǎo)培養(yǎng)EPC。CD133和VEGFR2免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定。計(jì)算并比較各實(shí)驗(yàn)組間EPC的數(shù)量。
　　結(jié)果:模型組大鼠門脈壓力顯著高于對(duì)照組和假手術(shù)組,肉眼下及鏡下可見食管胃底靜脈曲張明顯。原代培養(yǎng)后可見EPC形成克隆,培養(yǎng)2-3周后可見明顯具有典型EPC特征的細(xì)胞集落形成,培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)EP

3、C表面標(biāo)志物CD133和VEGF2-R。模型組EPC數(shù)量明顯高于對(duì)照組。
　　結(jié)論:采用門靜脈縮窄的方法,有效建立了大鼠門靜脈高壓癥食管靜脈曲張模型。EGM-2培養(yǎng)液培養(yǎng)外周血單個(gè)核細(xì)胞可以獲得內(nèi)皮祖細(xì)胞。內(nèi)皮祖細(xì)胞的水平可能與門靜脈高壓血管病變有關(guān)。
　　第二部分，食管粘膜下組織CD133和KDR的表達(dá)及意義
　　目的:檢測各實(shí)驗(yàn)組大鼠食管組織中CD133與VFGF的表達(dá),檢測大鼠不同階段血清中及食管組織勻漿液中VE

4、GF的表達(dá)。
　　方法:將各組大鼠按不同時(shí)間點(diǎn)剖殺取材,取食管組織一部分制作石蠟切片,一部分加裂解液勻漿。門靜脈采血離心收集血清。石蠟切片的食管組織HE染色后,NikonDigitalECLIPSEC1system共聚焦顯微鏡下拍照并用Image-ProPlus6.0軟件分析,計(jì)算食管粘膜下靜脈的密度及面積百分比。采用免疫組織化學(xué)方法檢測食管組織中CD133與VEGF的表達(dá),雙抗夾心法ELISA檢測大鼠血清及食管勻漿液中VEGF蛋

5、白水平。
　　結(jié)果:(1)靜脈曲張模型組中食管粘膜下血管密度明顯高于對(duì)照組,EPC細(xì)胞克隆數(shù)量與食管粘膜下靜脈數(shù)量/食管粘膜下層面積百分比,以及食管粘膜下靜脈面積/食管粘膜下層面積百分比均有顯著直線相關(guān)性。(2)門靜脈高壓癥食管靜脈曲張模型組大鼠食管粘膜下血管可見CD133和KDR陽性的內(nèi)皮細(xì)胞,假手術(shù)組大鼠未見CD133和KDR陽性內(nèi)皮細(xì)胞。(3)組織VEGF水平在各組間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,實(shí)驗(yàn)組術(shù)后第4周血清VEGF水平明顯上