IL-17A與巨噬細(xì)胞極化對(duì)實(shí)驗(yàn)性眼新生血管形成的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的：新生血管（neovascularization，NV）形成作為許多眼病的重要并發(fā)癥被廣泛研究，越來(lái)越多的研究表明它與炎癥和免疫細(xì)胞密切相關(guān)。本課題擬通過(guò)體內(nèi)外研究探討白細(xì)胞介素-17A（interleukine-17A，IL-17A）在眼NV形成中對(duì)巨噬細(xì)胞（macrophage，Mf）活化和極性轉(zhuǎn)變，進(jìn)而影響NV形成的作用和潛在機(jī)制。
　　方法：1.選擇 C57BL/6J小鼠分別建立氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變（oxygen-indu

2、ced retinopathy，OIR）模型、激光誘導(dǎo)脈絡(luò)膜NV形成模型（choroidal neovascularization，CNV），血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)高表達(dá)rho/VEGF轉(zhuǎn)基因小鼠模型。分別行玻璃體腔注射予 IL-17A中和抗體或重組IL-17A蛋白及PBS進(jìn)行干預(yù)，全視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜鋪片免疫熒光染色比較各組與同模型同齡對(duì)照組眼NV形成情況。

3、>　　2.選擇7日齡C57BL/6J野生型鼠和IL-17A基因敲除鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、OIR模型組，采用realtime RT-PCR法檢測(cè)比較NV形成中不同時(shí)點(diǎn)Mf極化相關(guān)炎癥因子表達(dá)；采用磁珠分離視網(wǎng)膜CD11b陽(yáng)性細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同時(shí)點(diǎn)視網(wǎng)膜M1和M2型細(xì)胞比例。
　　3.體外培養(yǎng)RAW264.7小鼠Mf細(xì)胞系，予不同濃度（0、10、50、100ng/ml） IL-17A重組蛋白干預(yù)24小時(shí)，采用western bl

4、ot法檢測(cè)細(xì)胞MAPK各活性亞基、AKT蛋白磷酸化狀態(tài)及Notch1蛋白的表達(dá)；realtime RT-PCR法檢測(cè)Mf極化相關(guān)基因mRNA表達(dá)；采用多因子檢測(cè)試劑盒檢測(cè)培養(yǎng)上清中相關(guān)炎癥因子表達(dá)；采用Griess反應(yīng)法檢測(cè)培養(yǎng)上清中一氧化氮（nitricmonoxide，NO）濃度。
　　4.體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs），分別予不同濃度（0

5、、10、50、100ng/ml）IL-17A重組蛋白或該蛋白干預(yù)RAW264.7細(xì)胞后的培養(yǎng)上清干預(yù)，采用CCK-8法檢測(cè)不同時(shí)間后HUVECs增殖情況，realtime RT-PCR檢測(cè)VEGFR1及VEGFR2 mRNA表達(dá)；采用Matrigel基質(zhì)膠檢測(cè)HUVECs管形成情況。
　　結(jié)果：IL-17A中和后的各模型小鼠視網(wǎng)膜或脈絡(luò)膜NV較同齡對(duì)照組顯著減少。IL-17A基因敲除鼠相較于野生型對(duì)照組M1相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)顯著下降