IL-17A對(duì)GM-CSF誘導(dǎo)的骨髓樹突狀細(xì)胞的影響.pdf

1、目的:
　　 用GM-CSF、LPS體外誘導(dǎo)小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞向樹突狀細(xì)胞(DC)分化及成熟，建立小鼠骨髓來(lái)源的樹突狀細(xì)胞(BMDC)體外擴(kuò)增模型。在BMDC誘導(dǎo)分化及成熟的不同階段加入不同濃度的rmIL-17，探討IL-17A對(duì)BMDC分化及成熟的影響。
　　 方法:
　　 為建立小鼠骨髓來(lái)源的樹突狀細(xì)胞(BMDC)體外擴(kuò)增模型，取6～8周的Balb/c小鼠的脛骨和股骨，用RPMI-1640培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔

2、，裂解紅細(xì)胞獲得骨髓單個(gè)核細(xì)胞。制備2×106細(xì)胞/ml加入含200U/ml GM-CSF10％胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)液培養(yǎng)8天，每隔3天補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)液。收獲懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞，用磁珠分選技術(shù)純化CD11c+細(xì)胞。純化細(xì)胞加入LPS刺激繼續(xù)培養(yǎng)36h使其充分成熟。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BMDC表面共刺激分子CD40、CD80、CD86和MHCⅡ的表達(dá)，采用ELISA方法檢測(cè)BMDC培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子IL-12p40、IL-10、I

3、L-6及TNF-α的分泌。為了進(jìn)一步探討IL-17A在BMDC分化及成熟過(guò)程中的作用，在用GM-CSF誘導(dǎo)BMDC分化時(shí)，分別加入低濃度及高濃度的rmIL-17A（10ng/ml、100ng/ml），8天后收獲懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞，分離純化的CD11c+細(xì)胞加入LPS及/或不同濃度的rmIL-17A（50ng/ml、100ng/ml、500ng/ml）繼續(xù)培養(yǎng)24h。利用流式細(xì)胞技術(shù)和ELISA方法分別檢測(cè)細(xì)胞表面共刺激分子CD40、CD80、

4、CD86和MHCⅡ的表達(dá)量以及細(xì)胞因子IL-12p40和IL-10的分泌。
　　 結(jié)果:
　　 小鼠骨髓來(lái)源的單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)GM-CSF誘導(dǎo)6-8天后細(xì)胞大量增殖并呈典型的DC細(xì)胞形態(tài)。LPS能夠有效的刺激GM-CSF誘導(dǎo)分化BMDC的成熟，表現(xiàn)為BMDC表面共刺激分子CD40、CD80和CD86的表達(dá)明顯高于不加LPS刺激組;細(xì)胞培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子IL-12p40、IL-10、IL-6和TNF-α的分泌量較不加LPS刺

5、激組顯著增加。為了探索IL-17A對(duì)BMDC前體表型和分化的影響，分離獲得BMDC前體細(xì)胞，加入低濃度rmIL-17A(10ng/ml)或高濃度rmIL-17A(100ng/ml)聯(lián)合GM-CSF培養(yǎng)8天。結(jié)果顯示:IL-17A能夠促進(jìn)GM-CSF誘導(dǎo)的BMDC表面共刺激分子CD40、CD86和MHCⅡ的表達(dá)，且具有一定的劑量依賴性。為了證實(shí)IL-17A能否對(duì)已分化BMDC的成熟產(chǎn)生影響，我們向GM-CSF誘導(dǎo)8天的BMDC中加入不同濃

6、度的rmIL-17A（50，100或者500ng/ml）繼續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng)36小時(shí)。結(jié)果顯示，與不加rmIL-17A的對(duì)照組比較，加入不同濃度的IL-17A及各濃度rmIL-17A組之間BMDC表面共刺激分子CD40、CD80、CD86和MHCⅡ的表達(dá)量均沒有明顯變化，且各組培養(yǎng)上清中IL-12p40和IL-10的含量沒有明顯變，提示IL-17A不具有刺激已分化的BMDC成熟的功能。但在GM-CSF誘導(dǎo)BMDC分化過(guò)程中加入不同濃度的rmIL

7、-17A，能夠上調(diào)LPS刺激的BMDC共刺激分子CD80、CD86和MHCⅡ的的表達(dá)及細(xì)胞因子IL-12p40和IL-10的分泌，提示BMDC誘導(dǎo)分化過(guò)程中加入IL-17A促進(jìn)LPS刺激的BMDC的成熟。
　　 結(jié)論
　　 一定劑量的GM-CSF能夠誘導(dǎo)骨髓來(lái)源的單個(gè)核細(xì)胞分化為DC，LPS能夠刺激GM-CSF誘導(dǎo)分化BMDC的成熟。成功建立了小鼠BMDC體外擴(kuò)增模型，為研究IL-17A對(duì)BMDC的影響提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。<