新生期肺炎鏈球菌感染對Th17-IL17影響在實(shí)驗(yàn)性哮喘中的作用研究.pdf

1、背景和目的：哮喘在兒童時(shí)期最常見，多數(shù)成人哮喘也在嬰幼兒時(shí)期起病，提示生命早期歷程在哮喘發(fā)病中有重要影響，越來越多研究表明生命早期細(xì)菌感染與以后哮喘發(fā)生相關(guān):孕期母親患慢性絨毛膜羊膜炎，孩子7歲前反復(fù)喘息及患哮喘風(fēng)險(xiǎn)增高;分娩時(shí)母親子宮有鏈球菌、厭氧菌感染，后代17歲時(shí)哮喘風(fēng)險(xiǎn)顯著增加;1歲內(nèi)反復(fù)呼吸道細(xì)菌感染是哮喘危險(xiǎn)因素。
　　肺炎鏈球菌是兒童社區(qū)獲得性呼吸道感染最常見細(xì)菌病原體，也是哮喘患者呼吸道常見分離菌。Bisgaard

2、等發(fā)現(xiàn)健康新生兒呼吸道有肺炎鏈球菌攜帶或感染，以后發(fā)生持續(xù)喘息、急性重癥喘息和因哮喘住院的風(fēng)險(xiǎn)增加，而1歲時(shí)呼吸道有肺炎鏈球菌定植或感染者，以后發(fā)生持續(xù)喘息、急性重癥喘息和因哮喘住院的風(fēng)險(xiǎn)不會(huì)增加，提示不同年齡時(shí)期肺炎鏈球菌感染對以后哮喘形成影響不同。本研究旨在探討新生期肺炎鏈球菌感染對實(shí)驗(yàn)性哮喘發(fā)生的影響及其發(fā)生機(jī)制，為哮喘防治提供新的干預(yù)思路。
　　第一部分、新生期小鼠非致死性肺炎鏈球菌感染模型建立方法的探討
　　肺炎鏈

3、球菌(Streptococcus pneumonia，S.p)主要定植于上呼吸道，可在鼻咽部黏膜存活數(shù)周，是兒童社區(qū)獲得性呼吸道感染最常見細(xì)菌病原體。感染模型建立是實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)，目前建立成年小鼠肺炎鏈球菌感染模型方法已經(jīng)成熟，但是如何建立新生期小鼠非致死性肺炎鏈球菌感染模型的方法尚未見報(bào)道。因此本研究探討建立新生期BALB/c小鼠非致死性肺炎鏈球菌感染模型的方法，為后期研究奠定模型基礎(chǔ)。
　　目的:探討建立新生期非致死性肺炎鏈球

4、菌感染BALB/c小鼠的方法。
　　方法:清潔級的新生期BALB/C小鼠80只，隨機(jī)分為肺炎鏈球菌感染1次組、感染2次組和對照組1、2，每組20只。感染1次組于新生期第7天分別經(jīng)鼻腔滴注D39肺炎鏈球菌107CFU、108CFU、109CFU、1010CFU液各10μl;感染2次組于新生期第6、7天連續(xù)2天經(jīng)鼻腔滴注D39肺炎鏈球菌107CFU、108CFU、109CFU、1010CFU液各10μl;對照組1、2于第7天和第6、7

5、天分別經(jīng)鼻腔滴注PBS液10μl。最后一次鼻腔滴注后24小時(shí)隨機(jī)抽取10只小鼠處死，取肺組織勻漿行細(xì)菌培養(yǎng)及鑒定，HE染色觀察肺組織病理改變。剩余10只連續(xù)觀察5天。
　　結(jié)果:感染2次109CFU肺炎鏈球菌組小鼠出現(xiàn)安靜少動(dòng)，皮膚蒼白，體重增長下降;其感染率與存活率均＞85％;小鼠肺組織細(xì)菌培養(yǎng)鑒定為肺炎鏈球菌;病理顯示肺部出現(xiàn)炎癥改變，肺泡間隔有增厚，血管和支氣管周圍有一定程度炎癥細(xì)胞浸潤。
　　結(jié)論:新生期第6、7天感

6、染109CFU肺炎鏈球菌是成功建立新生期BALB/c小鼠非致死性肺炎鏈球菌感染模型的較好方法。
　　第二部分、新生期肺炎鏈球菌感染對小鼠成年后哮喘影響的實(shí)驗(yàn)性研究
　　支氣管哮喘，是兒童最常見的慢性呼吸道疾病，其本質(zhì)是氣道的慢性炎癥，其病理變化與免疫系統(tǒng)的情況密切相關(guān)。但不能將哮喘的發(fā)病本質(zhì)簡單歸于Th1/Th2細(xì)胞的功能失衡，近年來研究發(fā)現(xiàn)TH17/IL-17在哮喘疾病的發(fā)病機(jī)制中扮演了重要的角色。Th17細(xì)胞是近年來發(fā)現(xiàn)

7、的CD4+T細(xì)胞亞群，不同于Th1、Th2和Treg細(xì)胞，以分泌IL-17這一促炎癥細(xì)胞因子為主，在自身免疫疾病及感染疾病中發(fā)揮重要作用。肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumonia, SP）是兒童社區(qū)獲得性呼吸道感染最常見細(xì)菌病原體，也是哮喘患者呼吸道常見分離菌。有臨床研究對于喘息和哮喘疾病的發(fā)生，肺炎鏈球菌的感染年齡是一個(gè)關(guān)鍵因素。本研究旨在進(jìn)一步研究生命早期感染肺炎鏈球菌對哮喘發(fā)生的影響及其機(jī)制。
　　目的:研

8、究生命早期感染肺炎鏈球菌是否通過TH17/IL-17影響哮喘發(fā)生及其機(jī)制。
　　方法:SPF級新生期BALB/c小鼠80只，隨機(jī)分為4組，分別為:肺炎鏈球菌感染哮喘組(S.p+OVA)、感染組(S.p)、哮喘組(OVA)和空白對照組(Control)。感染哮喘組和感染菌組均在小鼠出生6、7天通過鼻腔接種肺炎鏈球菌，感染哮喘組和哮喘組用OVA（卵清蛋白）致敏與激發(fā)。使用小鼠肺功能儀檢測小鼠的氣道高反應(yīng)性（AHR）;用HE染色后用顯微

9、鏡觀察小鼠肺組織的病理變化;光學(xué)顯微鏡計(jì)數(shù)小鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)中細(xì)胞分類;ELISA檢測BALF中INF-γ、IL-4、IL-5、IL-17、TGF-β及IL-10;流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測CD4+T細(xì)胞各亞群表達(dá)情況。
　　結(jié)果:S.p+OVA組小鼠出現(xiàn)明顯喘息癥狀;肺功能檢測發(fā)現(xiàn)該組氣道高反應(yīng)顯著高于單純的OVA組小鼠。S.p+OVA組和OVA組小鼠肺組織出現(xiàn)明顯炎癥，肺泡間隔有不同程度增厚，血管周圍和支氣管周圍存

10、在不同程度的炎癥細(xì)胞浸潤，S.p+OVA組較OVA組更嚴(yán)重。S.p+OVA組BALF中細(xì)胞總數(shù)明顯增加，分類比例嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞均有增加，以中性粒細(xì)胞增加最明顯。S.p+OVA組中TH1細(xì)胞與IFN-γ下降，TH17細(xì)胞與IL-17明顯上升;TH2與IL-4無明顯改變，但I(xiàn)L-5水平有所升高;Treg及其細(xì)胞因子無明顯改變。
　　結(jié)論:BALB/c小鼠新生期感染肺炎鏈球菌后通過影響TH17/IL-17可加重成年后