Th17-IL-17在兒童哮喘發(fā)病中的作用研究.pdf

1、第一部分哮喘兒童外周血Th17水平及其表達IL-17功能研究 第一節(jié)流式細胞術(shù)檢測人Th17細胞方法探討 目的：探討流式細胞術(shù)檢測人Th17細胞方法。 方法：收集健康兒童外周血，分離外周血單個核細胞（PBMC），使用不同劑量PMA、不同刺激培養(yǎng)時間處理后用流式細胞儀檢測Th17細胞百分率，檢測早期活化標記細胞膜CD69以及表達IFN-γ的Th1細胞作為細胞活化的參照，獲得最佳刺激劑量和培養(yǎng)時間。 結(jié)果：T

2、h17與Th1的活化條件不相同，PMA10-100μg/L加上Ionomycin和高爾基體阻斷劑，培養(yǎng)4-12 h以內(nèi)可獲得Th17較好檢測結(jié)果，過高的刺激劑量以及培養(yǎng)時間不能提高檢測水平反而影響Th17的檢測。 結(jié)論：本研究探討的流式細胞術(shù)檢測人Th17的方法指導臨床和科學研究。 第二節(jié)哮喘兒童外周血Th17水平及表達IL-17功能研究 目的：觀察哮喘急性發(fā)作期患兒外周血Th17水平和功能狀態(tài)，初步探討Th17

3、在兒童哮喘發(fā)病中的作用。 方法：以正常兒童（對照組，n=20）為對照，流式細胞術(shù)（FCM）檢測哮喘急性發(fā)作期患兒（哮喘組，n=30）外周血Th17以及Th1，Th2細胞百分率，Q-PCR方法檢測外周血單個核細胞（PBMC）IL-17 mRNA的表達，ELISA方法檢測體外培養(yǎng)上清IL-17，IFN-γ以及血漿IL-17，IL-23，IgE水平。 結(jié)果：（1）哮喘組和對照組外周血CD4+T中CD4+IL-17+T百分率[（

4、1.25±0.66）％vs（1.27±0.66）％（P>0.05）]；CD4+IL-4+T比例[（2.40±2.55）％vs（2.52±1.26）％（P>0.05）]；兩組比較無統(tǒng)計學意義。哮喘組CD4+IFN-γ+T比例顯著低于對照組[15.79±7.48 vs24.10±12.70（P<0.05）]。（2）哮喘組PBMC表達IL-17 mRNA顯著低于對照組（8.26（4.40-49.43）vs4.78（1.0-35.49）Z=1.

5、93 P=0.05）；PHA刺激PBMC體外培養(yǎng)72 h上清中，哮喘組IL-17水平顯著低于對照組[17.53（0～245.57）ng/L vs101.74（25.12～500.60）ng/L（P<0.01）]；IL-17 mRNA與蛋白水平呈正相關(guān)（r=0.76 P=0.01）。IFN-γ水平與對照組比較無統(tǒng)計學意義[3507±2788 ng/L vs3027±2737 ng/L]；兩組血漿中IL-17均<2ng/L，IL-23均<1

6、5 ng/L。（3）哮喘組血漿總IgE499.26（2.3～945.1）IU/mL，顯著高于對照組54.57（1.7～318.26）IU/mL（P<0.001）；IgE陽性（>150 IU/mL）和陰性（<150 IU/mL）哮喘患兒體外PBMC培養(yǎng)上清中IL-17，IFN-γ水平比較無統(tǒng)計學意義。 結(jié)論：哮喘急性發(fā)作期患兒外周血Th1細胞以及PHA活化的IL-17表達水平降低，Th1水平和Th17功能異常的機制及其在兒童哮喘發(fā)

7、病中的作用值得進一步研究。 第二部分 IL-17 G-152A基因多態(tài)性與兒童哮喘發(fā)病相關(guān)性研究 目的：分析中國西南地區(qū)漢族人群IL-17 G-152A多態(tài)性（rs2275913）與兒童哮喘發(fā)病的相關(guān)性。 方法：采用PCR-限制性片斷長度多態(tài)性（Restricion Fragment Length Polymorphism，RFLP）法分析88例哮喘患兒（哮喘組，其中51例為變應性哮喘），89例毛細支氣管炎患兒（

8、毛細支氣管炎組）和184例健康對照（對照組）IL-17 G-152A位點基因型。ELISA法檢測PHA誘導不同基因型PBMC表達IL-17水平。比較不同基因型哮喘患兒血清總IgE、肺功能及毛細支氣管炎患兒臨床特點。 結(jié)果：（1）IL-17 G-152A位點在中國西南地區(qū)存在多態(tài)性，各組基因型頻率符合Hardy-Weinberg平衡。健康人群A、G等位基因頻率分別41.6％、58.4％；AA、AG和GG基因型頻率分別14.7％、5

9、3.8％、31.5％（2）哮喘組G-152A位點等位基因以及基因型頻率與正常組比較有統(tǒng)計學差異，OR值及95％CI在A等位基因為1.44（1.00-2.06），P=0.048；在AA基因型為2.44（1.32-4.50），P=0.004。相對于變應性哮喘，A等位基因和AA基因型顯示更高的OR值。（3）基礎肺功能，血清總IgE平均水平在各基因型組間比較差異無統(tǒng)計學意義；但AA基因型中血清總IgE增高（>150 IU/mL）個體及肺功能FV

10、C、FEV1降低（<80％個人預測值）個體的比例顯著高于AG和GG基因型（P<0.05）。（4）PHA誘導的PBMC表達IL-17水平在各基因型組無顯著差異（5）毛細支氣管炎組基因型和等位基因頻率與正常組或哮喘組比較無統(tǒng)計學差異；結(jié)合臨床資料分析顯示AA基因型患兒鼻咽部肺炎鏈球菌檢出率較高（37.5％ vs2.5％，P=0.001）；AA基因型患兒住院時間較長（8.89±1.76 vs7.15±2.05，P=0.02），GG基因型喘息病

11、程較短（9.85±3.36 vs11.64±2.64，P=0.03）. 結(jié)論：本研究在基因水平提示IL-17與哮喘發(fā)病有關(guān)。IL-17 G-152A多態(tài)性（rs2275913）是中國西南地區(qū)兒童變應性哮喘發(fā)病的危險因素，AA基因型與哮喘患兒血清總IgE升高以及肺功能FVC、FEV1異常有關(guān)。在毛細支氣管炎患兒中發(fā)現(xiàn)該位點不同基因型間臨床表現(xiàn)存在差異，可能與發(fā)生哮喘有關(guān)。有待增加樣本量，以及進一步探討IL-17G-152A多態(tài)性對