丙戊酸鈉通過表觀遺傳通路下調(diào)鈉通道Scn3a基因表達的分子機制研究.pdf

1、【研究背景】癲癇是神經(jīng)系統(tǒng)疾病中除腦血管病以外最常見的一類疾病，其發(fā)病機制非常復雜,涉及到了一系列生理、生化、遺傳或者免疫等方面的變化，而神經(jīng)元中的鈉離子通道Scn3a基因表達上調(diào)可引起神經(jīng)元興奮性升高從而可能導致癲癇的發(fā)生。丙戊酸鈉( VPA)是一種臨床常用的廣譜抗癲癇藥，可以用來治療各種類型的癲癇以及慢性神經(jīng)痛、雙相情感障礙、偏頭痛等；有研究表明，VPA可以通過表觀遺傳或非表觀遺傳途徑來調(diào)控腦內(nèi)大量基因的表達；長期服用VPA的病人或

2、動物模型容易出現(xiàn)肥胖，而肥胖相關(guān)蛋白（FTO）和體重密切相關(guān)，同時該蛋白也是一種去甲基化酶。已有研究報道FTO可作為一種RNA去甲基化酶在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中通過表觀遺傳途徑參與癲癇的發(fā)生發(fā)展過程。據(jù)此我們推測 VPA可能是通過FTO介導的表觀遺傳途徑在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達。CpG二核苷酸上的胞嘧啶甲基化是一種常見的真核生物 DNA修飾，與癲癇在內(nèi)的幾種神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)病機制有密切關(guān)系。本課題組前期研究表明，在小鼠腦的發(fā)育及驚厥發(fā)病過程中，S

3、cn3a基因啟動子上-39C位點的動態(tài)甲基化參與調(diào)控Scn3a表達，進一步的研究表明甲基化結(jié)合蛋白2（MBD2，一種去甲基化酶）可以誘導-39C位點發(fā)生去甲基化，從而增加驚厥小鼠中Scn3a的表達，提示C pG甲基化在癲癇相關(guān)基因表達調(diào)控中發(fā)揮了重要作用。據(jù)此，我們推測， VPA可能通過去甲基化酶FTO和MBD2來調(diào)控Scn3a基因的表達從而發(fā)揮其抗癲癇作用。
　　【研究目的】本研究通過在體實驗與體外實驗相結(jié)合的方法，探索了去甲基

4、化酶FTO和MBD2參與 VPA調(diào)控Scn3a基因啟動子上-39C位點的甲基化狀態(tài)，從而下調(diào)Scn3a基因表達這一表觀遺傳途徑。以期從鈉通道基因表觀調(diào)控的角度解釋VPA的一種新型抗癲癇分子機制，為VPA的抗癲癇作用提供了新的見解，并為其開發(fā)出新的臨床用途及預防副作用等提供理論依據(jù)。
　　【研究方法】
　　1.提取藥物處理和/或敲降MBD2或FTO表達的Neuro-2a細胞和小鼠模型海馬組織的總RNA、總蛋白；
　　2.

5、采用熒光定量 PCR和 Western blot在 mRNA及蛋白水平上檢測 Fto、Mbd2以及Scn3a在處理前后的變化；
　　3.采用重亞硫酸氫鹽（BSP法）對DNA進行轉(zhuǎn)換，再采用直接測序法檢測VPA處理前后Scn3a啟動子上-39C位點的甲基化程度；
　　4.構(gòu)建含Mbd2基因3′UTR和含Scn3a基因野生型及其突變型啟動子的熒光素酶報告基因表達，轉(zhuǎn)染Neuro-2a細胞后經(jīng)不同條件處理，采用雙熒光素酶報告基因系

6、統(tǒng)檢測酶活性。
　　【研究結(jié)果】
　　1.在Neuro-2a細胞中，經(jīng)0.5 mM和1 mM的VPA處理72小時后，Scn3a mRNA水平有明顯下降，而在用CBZ和LTG處理的細胞中未觀察到該種劑量依賴性變化；
　　2.在Neuro-2a細胞中，用0.5 mM的VPA處理細胞72小時后，NaV1.3蛋白水平與陰性對照組相比下降約50％；
　　3.為了檢測VPA對Scn3a基因啟動子的影響，在Neuro-2a細胞

7、中轉(zhuǎn)染了Scn3a啟動子報告基因，再用VPA處理，雙熒光素酶報告基因活性檢測結(jié)果可見，VPA處理過的細胞中熒光素酶活性（Luc2/ Renilla）明顯低于沒有處理的對照組；
　　4. BSP法發(fā)現(xiàn) Scn3a啟動子-39C位點發(fā)生甲基化動態(tài)變化；進一步發(fā)現(xiàn)VPA可以促進-39C位點發(fā)生甲基化改變；而-39C位點突變后降低了 Neuro-2a細胞內(nèi)熒光素酶報告基因的活性；
　　5.在Neuro-2a細胞中，用0.5 mM的V

8、PA處理細胞72小時后，MBD2蛋白水平是陰性對照組的0.3倍；進一步實驗發(fā)現(xiàn) VPA處理的細胞內(nèi) MBD2 mRNA水平未發(fā)現(xiàn)明顯差異，而 VPA處理后的細胞中 psiCHEC-MBD2-3UTR報告基因的熒光素酶活性明顯低于陰性對照組；
　　6.在敲降細胞中的MBD2蛋白表達的情況下，發(fā)現(xiàn)Scn3a mRNA水平與陰性對照組相比明顯降低；
　　7.在Neuro-2a細胞中，用0.5 mM的VPA處理細胞72小時后，F(xiàn)to

9、 mRNA水平及蛋白水平均升高；
　　8.為了進一步研究FTO是否參與了VPA通過MBD2來調(diào)控NaV1.3這一通路，在細胞內(nèi)敲降FTO蛋白表達，發(fā)現(xiàn)MBD2和NaV1.3水平均升高，而在敲降FTO的基礎(chǔ)上再用VPA處理，發(fā)現(xiàn)VPA降低MBD2和NaV1.3表達的能力減弱；
　　9.在癲癇動物模型中，經(jīng)過1周VPA處理后的驚厥小鼠海馬組織中，Scn3a和Fto的mRNA水平是分別是驚厥小鼠組的0.6和1.4倍，但是Mbd2

10、mRNA水平在這兩組中無明顯統(tǒng)計學差異；用CBZ和LTG處理的驚厥小鼠體內(nèi)，這三個基因均無統(tǒng)計學差異；經(jīng)過 VPA處理后的驚厥小鼠海馬中，NaV1.3和MBD2蛋白水平比驚厥小鼠組的明顯降低，然而 FTO的蛋白水平卻比驚厥小鼠組的升高了。
　　【結(jié)論】本研究發(fā)現(xiàn)，丙戊酸鈉（VPA）可通過誘導Scn3a基因啟動子上-39C位點的甲基化，導致其啟動子活性下降從而下調(diào) Scn3a基因的表達，而去甲基化酶 FTO和MBD2均參與了這一過程