鈉通道Scn3a基因的表觀調(diào)控及其在癲癇發(fā)生機(jī)制中的作用.pdf

1、研究背景：
　　癲癇的發(fā)病與SCN3A編碼的Nav1.3通道密切相關(guān)。Beckh等人在1989年已在小鼠身上中證實小鼠Scn3a(mScn3a)的表達(dá)主要發(fā)生在小鼠的幼年期，成年期幾乎沒有表達(dá)。在小鼠胚胎期中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要經(jīng)Nav1.3通道來維持神經(jīng)細(xì)胞的興奮性，而在成年期小鼠主要以Nav1.1通道來維持神經(jīng)細(xì)胞的興奮性。在對癲癇的大量研究中，SCN3A突變導(dǎo)致癲癇只發(fā)現(xiàn)一種，然而研究發(fā)現(xiàn)SCN3A基因與癲癇的發(fā)生密切相關(guān)。許多研

2、究證實不管是在原發(fā)性癲癇和繼發(fā)性癲癇中Ⅲ型納離子通道基因的表達(dá)均呈現(xiàn)為高水平，這可能是影響癲癇發(fā)病其中一個重要原因。研究發(fā)現(xiàn)在小鼠癲癇的持續(xù)狀態(tài)中有許多基因的甲基化程度是下調(diào)的，也有一部分是上調(diào)的，而Scn3a的甲基化狀態(tài)改變及其如何起調(diào)控作用卻未清楚。
　　研究目的:
　　通過鑒定小鼠Scn3a基因啟動子上受CpG甲基化調(diào)控的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，分析這些元件與Scn3a基因時空表達(dá)的相關(guān)性；分析Scn3a基因啟動子上CpG位點(diǎn)甲

3、基化水平與癲癇發(fā)生的相關(guān)性；以期揭示CpG甲基化調(diào)控Scn3a基因表達(dá)的分子機(jī)制及其在癲癇發(fā)生中的作用，為癲癇的產(chǎn)前診斷及治療提供新的參考依據(jù)。
　　研究方法:
　　1.小鼠發(fā)育過程的分析
　　1.1 采用生物信息學(xué)分析小鼠Scn3a核心啟動子上CpG位點(diǎn)的分析。
　　1.2 采用PCR及熒光定量PCR進(jìn)行小鼠Scn3a mRNA水平的分析。
　　1.3 采用重亞硫酸氫鹽（BSP法）對DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)換，再采用

4、直接測序法檢測DNA的甲基化程度。
　　1.4 采用定點(diǎn)誘變的方法構(gòu)建突變表達(dá)載體，在N1E-115細(xì)胞中進(jìn)行雙熒光素酶報告基因活性檢測。
　　1.5 采用EMSA實驗檢測Scn3a基因啟動子與細(xì)胞核蛋白之間體外的結(jié)合。
　　1.6 采用染色質(zhì)免疫共沉淀實驗檢測蛋白與DNA在組織和細(xì)胞中的結(jié)合情況。
　　2.癲癇狀態(tài)下啟動子與蛋白結(jié)合的分析
　　2.1 采用PCR及熒光定量PCR檢測各中樞型鈉離子通道及Mb

5、d2的mRNA水平。
　　2.2 采用重亞硫酸氫鹽對DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)換，再采用直接測序法檢測DNA的甲基化程度。
　　2.3 采用supershift-EMSA實驗檢測Scn3a可以結(jié)合何種蛋白。
　　2.4 采用Western Blot方法檢測MBD2蛋白的表達(dá)水平。
　　2.5 采用EMSA的方法檢測啟動子DNA與核蛋白的結(jié)合能力。
　　2.6 采用染色質(zhì)免疫共沉淀的方法檢測蛋白結(jié)合啟動子DNA的能力。

6、r>　　研究結(jié)果:
　　1.小鼠發(fā)育過程中Scn3a啟動子動態(tài)甲基化變化及MBD2蛋白參與Scn3a基因啟動子的作用
　　小鼠Scn3a基因核心啟動子存在7個CpG位點(diǎn)，-39C位點(diǎn)發(fā)生甲基化的動態(tài)改變；-39C對熒光報告基因產(chǎn)生重要的影響，其甲基化的改變降低了熒光素報告基因的活性；-39C位點(diǎn)能募集細(xì)胞核蛋白結(jié)合到 Scn3a基因啟動子上影響 Scn3a基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)；Supershift-EMSA和染色質(zhì)免疫共沉淀證實

7、 MBD2能結(jié)合到 Scn3a啟動子上。
　　2.癲癇小鼠Scn3a基因啟動子低甲基化及癲癇狀態(tài)下MBD2蛋白與啟動子的作用
　　在癲癇小鼠各中樞型鈉離子通道中只有Scn3a的mRNA水平發(fā)生明顯改變；Scn3a基因啟動子中-39C甲基化發(fā)生低甲基化改變；在癲癇癇性發(fā)作中MBD2蛋白呈動態(tài)性變化，并通過作用于-39C CpG位點(diǎn)結(jié)合于小鼠Scn3a基因啟動子上；癲癇小鼠中MBD2結(jié)合Scn3a基因啟動子的能力減弱。