TUBB3在癲癇中的作用和機(jī)制研究.pdf

1、第一部分 TUBB3在難治性癲癇患者及動(dòng)物模型中的表達(dá)
　　目的：檢測 TUBB3在難治性癲癇患者及兩種慢性癲癇大鼠模型腦組織中的表達(dá)情況。
　　方法：
　　1.從課題組建立的由300多例難治性TLE患者術(shù)后腦組織組成的腦庫中隨機(jī)抽取癲癇腦組織標(biāo)本（實(shí)驗(yàn)組）30例，非癲癇腦外傷患者腦組織（顳葉皮質(zhì)）標(biāo)本作為對照組10例。
　　2.成年雄性SD大鼠（體重220±20g，7-8周齡），氯化鋰-匹羅卡品腹腔注射誘導(dǎo)癲癇

2、持續(xù)狀態(tài)（SE），構(gòu)建 SE后慢性 TLE模型，分為有自發(fā)性反復(fù)癲癇發(fā)作組（SRS,6w，n=8）和無自發(fā)性反復(fù)癲癇發(fā)作組（non-SRS,6w，n=8）。
　　3.構(gòu)建戊四氮（PTZ）慢性點(diǎn)燃大鼠模型，分為點(diǎn)燃成功組（n=8）和未點(diǎn)燃成功組（n=8）。
　　4.用免疫印跡方法檢測TUBB3表達(dá)情況，免疫熒光檢測TUBB3表達(dá)部位。
　　結(jié)果：
　　1.難治性TLE患者術(shù)后腦組織及對照腦組織中均有TUBB3表達(dá)，

3、且TUBB3在癲癇患者術(shù)后腦組織中表達(dá)較對照組顯著增高（★p＜0.05）。
　　2.在氯化鋰-匹羅卡品誘導(dǎo)的慢性癲癇大鼠模型中，有自發(fā)性發(fā)作的大鼠皮質(zhì)和海馬 TUBB3表達(dá)水平均較無自發(fā)性發(fā)作組明顯增高（★★★p＜0.001,＃p＜0.05）；PTZ慢性點(diǎn)燃模型中，點(diǎn)燃成功組大鼠皮質(zhì)和海馬TUBB3表達(dá)水平均較未點(diǎn)燃組顯著增高（★p＜0.05,＃＃p＜0.01）。
　　3.癲癇患者腦組織中免疫熒光顯示TUBB3免疫反應(yīng)陽性細(xì)

4、胞有較長突起，主要在神經(jīng)元胞質(zhì)和軸突初段表達(dá)，且與抑制性神經(jīng)元標(biāo)記物（GAD67）和成熟的抑制性突觸標(biāo)記物（Gephyrin）共表達(dá),與興奮性突觸標(biāo)記物（PSD95）無共表達(dá);并在慢性癲癇大鼠模型腦組織中得到驗(yàn)證。
　　結(jié)論：
　　難治性TLE患者和兩種慢性癲癇大鼠模型腦組織中TUBB3表達(dá)均明顯增加，且TUBB3與抑制性突觸共表達(dá)，提示TUBB3可能參與了癲癇的發(fā)生發(fā)展。
　　第二部分 TUBB3對兩種癲癇動(dòng)物模型行

5、為學(xué)的影響
　　目的：為進(jìn)一步探討 TUBB3在癲癇發(fā)生發(fā)展中的作用，我們構(gòu)建了TUBB3-shRNA和TUBB3過表達(dá)基因的腺相關(guān)病毒(AAV)載體，通過海馬立體定位注射改變大鼠海馬TUBB3表達(dá)，觀察TUBB3對PTZ慢性點(diǎn)燃模型和匹羅卡品慢性癲癇模型行為學(xué)的影響。
　　方法：
　　1.構(gòu)建攜帶有 TUBB3-shRNA和 TUBB3過表達(dá)基因的腺相關(guān)病毒載體。
　　2.成年雄性 SD大鼠隨機(jī)分為三組：海馬立

6、體定位注射腺相關(guān)病毒空載體組（AAV-GFP）；腺相關(guān)病毒TUBB3-shRNA組（AAV-TUBB3-shRNA）；腺相關(guān)病毒TUBB3過表達(dá)組（AAV-TUBB3）。
　　3.分別用免疫熒光、免疫印跡技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染效率。
　　4. PTZ慢性點(diǎn)燃模型行為學(xué)觀察：在沉默TUBB3和過表達(dá)TUBB3的癲癇模型中，我們利用閾下劑量PTZ，每隔48 h進(jìn)行1次，觀察點(diǎn)燃過程中各時(shí)間點(diǎn)平均發(fā)作分級。
　　5.氯化鋰-匹羅卡品癲

7、癇模型行為學(xué)觀察：在沉默 TUBB3和過表達(dá)TUBB3的癲癇模型中，造模后持續(xù)視頻監(jiān)測大鼠 SRS情況。統(tǒng)計(jì) SRS次數(shù)和用Racine評分評估發(fā)作的嚴(yán)重程度。
　　結(jié)果：
　　1. AAV-TUBB3-shRNA、AAV-TUBB3和AAV-GFP海馬立體定位注射后，免疫熒光結(jié)果顯示海馬CA1和齒狀回均有GFP陽性表達(dá)。免疫印跡結(jié)果顯示，與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)對照組相比，TUBB3-shRNA組OD值在病毒注射后第3周和第9周顯著降

8、低（★★P<0.01），TUBB3過表達(dá)組OD值在病毒注射后第3周和第9周顯著增加（★★P<0.01）。
　　2. PTZ慢性點(diǎn)燃過程中，與對照組相比，TUBB3-shRNA組各時(shí)間點(diǎn)平均發(fā)作分級顯著降低，TUBB3過表達(dá)組各時(shí)間點(diǎn)平均發(fā)作分級顯著升高（★P<0.05，★★P<0.01）。
　　3.氯化鋰-匹羅卡品誘導(dǎo)的SE后慢性期內(nèi)（3-6 w）,與對照組相比， TUBB3-shRNA組自發(fā)性發(fā)作次數(shù)和5級發(fā)作比例顯著降低

9、，TUBB3過表達(dá)組自發(fā)性發(fā)作次數(shù)和5級發(fā)作比例顯著升高（★P<0.05，★★P<0.01，★★★P<0.001）。
　　結(jié)論：
　　1.腺相關(guān)病毒TUBB3-shRNA或TUBB3過表達(dá)海馬立體定位注射后可顯著改變海馬TUBB3的表達(dá)，轉(zhuǎn)染在注射后3周有效，可持續(xù)至9周。
　　2.腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的海馬TUBB3-shRNA能減輕PTZ慢性點(diǎn)燃過程中各時(shí)間點(diǎn)平均發(fā)作分級，TUBB3過表達(dá)產(chǎn)生相反的結(jié)果。
　　3.

10、腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的海馬 TUBB3-shRNA能減少氯化鋰-匹羅卡品誘導(dǎo)的慢性期自發(fā)性發(fā)作的次數(shù)并減輕發(fā)作嚴(yán)重程度，TUBB3過表達(dá)產(chǎn)生相反的結(jié)果。
　　第三部分 TUBB3在癲癇發(fā)作中的作用機(jī)制
　　目的：探討 TUBB3對點(diǎn)燃動(dòng)物神經(jīng)元抑制功能的影響及其可能的潛在機(jī)制。
　　方法：
　　1.取25只成年雄性清潔級SD大鼠，根據(jù)海馬內(nèi)立體定位注射試劑不同分為三組： AAV-TUBB3-sh組、AAV-TUBB3組

11、和AAV-GFP組。
　　2.三周后構(gòu)建PTZ慢性點(diǎn)燃大鼠模型，取材制作海馬腦片。采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測各組海馬 CA1區(qū)錐體神經(jīng)元抑制性突觸后電流（mIPSC）和成對脈沖比例（PPR)的變化情況。
　　3.免疫印跡法檢測 PTZ慢性點(diǎn)燃成功后大鼠海馬 GABA-A受體β2/3的總蛋白和膜蛋白表達(dá)情況。
　　4.免疫共沉淀檢測PTZ慢性點(diǎn)燃成功后大鼠海馬中TUBB3、GABARAP和 GABA-A受體β2/3三者相互

12、作用情況。
　　結(jié)果：
　　1.全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)對CA1區(qū)錐體神經(jīng)元記錄結(jié)果顯示，與對照組相比，TUBB3-shRNA組中 mIPSC幅度顯著增高(★P<0.05)；TUBB3過表達(dá)產(chǎn)生了相反的效果；mIPSC頻率在 TUBB3-shRNA組與 GFP組之間無顯著性差異(P＞0.05)；TUBB3-shRNA組與 GFP組相比，PPR無顯著性差異（P＞0.05）。
　　2.免疫印跡結(jié)果顯示，TUBB3-shRNA組GA

13、BA-A受體β2/3膜蛋白/總蛋白比值顯著增加(★P<0.05)，TUBB3過表達(dá)組膜蛋白/總蛋白比值明顯降低(★P<0.05)；GABA-A受體總蛋白表達(dá)量無顯著變化(P＞0.05)；GluR2/3無顯著性差異（P＞0.05）。
　　3.免疫共沉淀結(jié)果顯示癲癇大鼠海馬組織中內(nèi)源性TUBB3和內(nèi)源性GABARAP、GABA-A受體三者相互作用。
　　結(jié)論：
　　1.癲癇大鼠海馬中下調(diào) TUBB3能顯著增加海馬 CA1區(qū)