糖酵解酶GAPDH對(duì)鈉通道基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控及其在驚厥發(fā)生與生酮飲食抗驚厥中的作用機(jī)制.pdf

1、【目的】：
　　癲癇是大腦神經(jīng)元高度同步化異常放電所導(dǎo)致的，以驚厥反復(fù)發(fā)作為臨床特征的一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病?，F(xiàn)已證實(shí)電壓依賴性鈉離子通道（VGSC）功能及表達(dá)異常與癲癇發(fā)病密切相關(guān)，其中鈉通道基因SCN1A表達(dá)水平下降及SCN3A表達(dá)水平上升被認(rèn)為是促進(jìn)癲癇發(fā)生發(fā)展的重要原因。生酮飲食（Ketogenic diet， KD）是一種高脂低碳水化合物的飲食療法，主要用于治療兒童難治性癲癇。過去多項(xiàng)研究提示， KD可能通過改變腦的能量

2、代謝方式從基因表達(dá)調(diào)控、離子通道、抗氧化、神經(jīng)保護(hù)、神經(jīng)遞質(zhì)釋放和突觸傳遞等多條途徑來調(diào)節(jié)細(xì)胞特性，降低神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)興奮性和緩沖樣放電，從而起到抗癲癇作用。但其確切的分子機(jī)制仍有待于深入研究。
　　甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Glyceraldehyde3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）是糖酵解途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶?，F(xiàn)已證實(shí)，GAPDH還作為RNA結(jié)合蛋白參與其他基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。本研究發(fā)現(xiàn)，GAPDH與人和小

3、鼠的SCN1A與SCN3A基因3′UTR區(qū)的一個(gè)保守區(qū)相結(jié)合，由此推測(cè)GAPDH所介導(dǎo)的鈉通道基因表達(dá)調(diào)控很可能在癲癇及KD抗癲癇機(jī)制中發(fā)揮重要作用。
　　本研究擬通過體外及在體實(shí)驗(yàn)探索GAPDH參與調(diào)控鈉通道基因表達(dá)的分子機(jī)制及其在驚厥發(fā)生及KD抗驚厥中的可能作用，為進(jìn)一步了解癲癇的發(fā)病機(jī)制及優(yōu)化臨床診治措施提供參考依據(jù)。
　　【方法】：
　　1、保守性分析：采用VectorNTI軟件對(duì)人和小鼠SCN1A與SCN3A

4、基因3′UT R區(qū)序列進(jìn)行對(duì)比，獲得保守序列。
　　2、RNA Electrophoretic Mobility Shift Assay（RNA-EMSA）：以生物素標(biāo)記的RNA保守序列作為探針，采用RNA-EMSA實(shí)驗(yàn)分析保守序列與細(xì)胞漿蛋白結(jié)合情況。
　　3、RNA Pull-down：采用Pull-down實(shí)驗(yàn)分離與保守序列結(jié)合的蛋白復(fù)合物，并采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS/MS）分析復(fù)合物的蛋白成員。
　

5、　4、Supershift實(shí)驗(yàn)：加入蛋白抗體，采用Supershift-EMSA實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證與CS1相結(jié)合的蛋白。
　　5、質(zhì)粒構(gòu)建：采用T-A克隆技術(shù)，構(gòu)建鈉通道基因3′UT R雙熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體；并以此為模板，采用定點(diǎn)誘變技術(shù)，構(gòu)建缺失保守序列的載體（CS-Del型）。
　　6、雙熒光報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)：將重組的雙熒光素酶表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至培養(yǎng)細(xì)胞，收獲并裂解細(xì)胞，采用雙贏素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)報(bào)告基因表達(dá)活性。
　

6、　7、ShRNA敲降（ShRNA knockdown）：從上海吉瑪基因公司定制GAPDH特異敲降的ShRNA表達(dá)質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染至培養(yǎng)細(xì)胞，采用Western blot分析敲降效果。
　　8、mRNA穩(wěn)定性分析：放線菌素D處理培養(yǎng)細(xì)胞，分別在0、3、5小時(shí)時(shí)間點(diǎn)，提取細(xì)胞總RNA，采用qRT-PCR檢測(cè)報(bào)告基因mRNA水平。
　　9、驚厥動(dòng)物模型構(gòu)建及KD處理：采用注射海人酸方法構(gòu)建驚厥小鼠模型，待觀察到驚厥表現(xiàn)后，部分小鼠喂食

7、KD飼料。
　　10、β-Hydroxybutyric acid（BHB）處理：使用5 mM的BHB處理細(xì)胞，分析處理后GAPDH及鈉通道基因表達(dá)情況。
　　11、蛋白免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）：采用免疫沉淀技術(shù)純化組織及細(xì)胞中的GAPDH蛋白。
　　12、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）：用于檢測(cè)組織及細(xì)胞的相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平。
　　13、蛋白磷酸化檢測(cè)：使用Phosph

8、o-PKC抗體，在Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)組織及細(xì)胞的GAPDH蛋白Thr-244位點(diǎn)磷酸水平。
　　【結(jié)果】：
　　1、保守性分析發(fā)現(xiàn)，人及小鼠的SCN1A和SCN3A基因3′UTR存在3個(gè)共同保守區(qū)（分別命名CS1、CS2和CS3）；RNA-EMSA證實(shí)，只有CS1能特異性結(jié)合細(xì)胞漿蛋白；進(jìn)一步采用Pull-down聯(lián)合SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與CS1結(jié)合的蛋白復(fù)合物分子量大約為35-40kDa；LC-MS/M

9、S測(cè)序及Surper-shift EMSA證實(shí)，GAPDH與CS1相結(jié)合。
　　2、報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示，SCN1A基因3′UTR中CS1的缺失能顯著性增強(qiáng)報(bào)告基因表達(dá)活性，而SCN3A基因3′UTR中CS1的缺失對(duì)報(bào)告基因表達(dá)活性沒有影響；當(dāng)敲降GAPDH表達(dá)時(shí)，可增強(qiáng)含SCN1A基因3′UTR的報(bào)告基因表達(dá)，而下調(diào)含SCN3A基因3′UTR的報(bào)告基因表達(dá)，對(duì)含有缺失CS1的SCN1A、SCN3A基因3′UTR的報(bào)告基因表達(dá)均無

10、影響；進(jìn)一步分析GAPDH對(duì)報(bào)告基因mRNA穩(wěn)定性分析發(fā)現(xiàn)，GAPDH敲降導(dǎo)致含SCN1A基因3′UTR的報(bào)告基因mRNA穩(wěn)定性增強(qiáng)，而含SCN3A基因3′UTR的報(bào)告基因mRNA穩(wěn)定性減弱。上述結(jié)果提示：GAPDH可通過與CS1元件影響mRNA穩(wěn)定性來下調(diào)SCN1A基因表達(dá)，上調(diào)SCN3A基因表達(dá)。
　　3、與正常小鼠相比較，驚厥小鼠海馬組織中Scn1a的mRNA表達(dá)下調(diào)，而Scn3a的mRNA表達(dá)上調(diào)，GAPDH表達(dá)上調(diào)；與正

11、常飲食的驚厥小鼠相比較，KD飲食的驚厥小鼠Scn1a表達(dá)上調(diào)，而Scn3a表達(dá)水平下調(diào)，同樣GAPDH表達(dá)下調(diào)。這些結(jié)果提示在驚厥及KD條件下，GAPDH很可能參與Scn1a和Scn3a基因的表達(dá)改變。
　　4、通過純化小鼠海馬組織G APD H并進(jìn)行磷酸化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與正常小鼠相比較，驚厥小鼠GAPDH蛋白Thr-244位點(diǎn)磷酸化水平顯著性增加，且與CS1元件結(jié)合能力增強(qiáng)，而在KD飲食的驚厥小鼠中GAPDH磷酸化水平回復(fù)到正常小鼠

12、水平，與CS1結(jié)合能力減弱；進(jìn)一步體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，GAPDH去磷酸化后影響到蛋白與調(diào)控元件的結(jié)合。上述結(jié)果表明：在驚厥及KD條件下，GAPDH磷酸化修飾很可能參與Scn1a和Scn3a基因的表達(dá)改變。
　　5、為了進(jìn)一步證實(shí)KD在調(diào)控鈉通道基因中的作用，本研究體外分析了KD的一種代謝產(chǎn)物BHB對(duì)GAPDH及鈉通道表達(dá)的影響。在BHB處理的
　　N1E-115細(xì)胞中，GAPDH表達(dá)下調(diào)，GAPDH蛋白Thr-244位點(diǎn)發(fā)生去磷酸

13、化，并且BHB處理N1E-115細(xì)胞中表達(dá)的GAPDH對(duì)CS1結(jié)合能力下降；同樣， BHB可導(dǎo)致Scn1a表達(dá)上調(diào)和Scn3a表達(dá)下調(diào)。雙熒光素酶報(bào)告基因活性檢測(cè)結(jié)果顯示：BHB可增強(qiáng)含Scn1a基因3′UTR的報(bào)告基因表達(dá)，而下調(diào)含Scn3a基因3′UTR的報(bào)告基因表達(dá)。上述結(jié)果證實(shí)：BHB通過下調(diào)GAPDH及其去磷酸化來調(diào)控鈉通道基因的表達(dá)。
　　【結(jié)論】：
　　本研究證實(shí)GAPDH可通過與鈉通道基因3′UTR的保守序列