丙戊酸鈉聯(lián)合雌激素對去卵巢癡呆小鼠的作用及其機制的初步研究.pdf

1、目的：
　　研究雌激素缺乏不同時間段癡呆模型小鼠腦內(nèi)雌激素受體（Estrogen receptors,ERs）及糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase3β）的動態(tài)變化，并觀察丙戊酸鈉(valproic acid sodiumsalt，VPA)聯(lián)合雌激素對APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因去勢AD模型小鼠腦內(nèi)雌激素受體含量及GSK-3β相關(guān)信號通路的影響，探討相關(guān)的作用機制。本課題研究成果將為進一步揭示AD的發(fā)病機

2、制及臨床上研究和開發(fā)治療AD的多靶向藥物提供新的實驗室依據(jù)。
　　方法：
　　本課題分兩部分進行。第一部分：選取3月齡雌性APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠40只，將其隨機分為假手術(shù)組(AD-Sham組)和手術(shù)組(AD-OVX組)，同月齡野生型小鼠為對照組(WT組)，每組10只。分別于術(shù)后1個月和術(shù)后5個月，采用多種方法檢測小鼠外周血雌激素水平、行為學、腦組織形態(tài)學及相關(guān)蛋白的變化。
　　第二部分：選取去勢后1個月癡呆模型小鼠

3、進行藥物治療,隨機平均分為6組：生理鹽水對照組、VPA藥物處理組、E2藥物處理組、Liq藥物處理組、VPA聯(lián)合E2藥物處理組及VPA聯(lián)合Liq藥物處理組，每組8只。VPA藥物處理組小鼠給予藥物VPA30mg/kg·d，雌激素藥物處理組給予E2藥物2.4ug/只·d，Liq治療組給予Liq50ug/kg·d,VPA和E2聯(lián)合治療組給予VPA30mg/kg·d和E22.4ug/只·d，VPA和Liq聯(lián)合治療組給予VPA30mg/kg·d和L

4、iq50ug/kg·d,生理鹽水治療組給予等量生理鹽水，除Liq給藥方式為灌胃外，其余給藥均為腹腔注射。
　　藥物處理1個月后，采用高架十字迷宮及曠場實驗以檢測各組小鼠的抑郁焦慮行為；Morris水迷宮檢測小鼠的空間學習及記憶能力；利用蛋白印跡（Western blot）等技術(shù)，檢測聯(lián)合用藥對小鼠腦內(nèi)雌激素受體含量，GSK-3β活性及老年斑的影響，并探討其相關(guān)機制。
　　結(jié)果：
　　1.第一部分實驗結(jié)果：OVX1個月和

5、5個月組AD小鼠體循環(huán)雌激素水平顯著下調(diào)（P＜0.05）；OVX1個月組小鼠子宮無明顯縮小，而OVX5個月出現(xiàn)明顯萎縮。Morris水迷宮顯示，OVX1個月后，與AD-Sham組相比，AD-OVX組小鼠找到平臺的逃避潛伏期和路程顯著增加(P＜0.05)，跨越平臺的次數(shù)明顯減小(P＜0.05)。隨著OVX時間的延長，至OVX5個月后，AD-OVX組小鼠找到平臺的時間和經(jīng)過的路程更進一步延長(P＜0.05)，跨越平臺的次數(shù)也相應(yīng)下降(P＜0

6、.05)。免疫熒光結(jié)果顯示，與AD-Sham組相比，AD-OVX1個月和5個月組小鼠腦內(nèi)老年斑均顯著增加(P＜0.05)。Western blot結(jié)果顯示，與AD-Sham組相比，AD-OVX1個月及5個月組小鼠腦內(nèi)ERβ蛋白水平出現(xiàn)進行性下調(diào)(P＜0.05)；相應(yīng)地，AD-OVX組小鼠腦內(nèi)p-GSK-3β水平降低的趨勢與ERβ一致(P＜0.05)，盡管正常小鼠和AD小鼠腦內(nèi)GSK-3β總蛋白無明顯差異(P＞0.05)。
　　2.

7、第二部分實驗結(jié)果：
　　1、行為學
　　1）高架十字迷宮檢測結(jié)果顯示：聯(lián)合藥物處理組小鼠在開放臂活動次數(shù)明顯增多（P＜0.05），聯(lián)合藥物處理組在開放臂停留的時間與其余各組相比均明顯延長（P＜0.01）。在開放臂活動次數(shù)及開放臂停留時間的比率上，VPA與E2聯(lián)合處理組均明顯增加（P＜0.01），Liq處理組也明顯增加（P＜0.05）；VPA與E2，VPA與Liq聯(lián)合處理組較VPA及E2單獨藥物處理組也顯著增加（P＜0.05）

8、。
　　2）水迷宮實驗結(jié)果：可視平臺條件下，各組藥物處理小鼠找到平臺的時間和路程均無明顯的差異（P＞0.05）。隱蔽平臺實驗條件下，其他各藥物處理組小鼠找到隱蔽平臺的游動時間及路程與生理鹽水對照組相比均明顯縮短（P＜0.05）；而聯(lián)合藥物處理組游動時間及距離更加縮短（P＜0.05）?？臻g探索實驗中，與生理鹽水組比較，聯(lián)合藥物處理組穿越平臺的次數(shù)明顯增多（P＜0.01），單一藥物處理組也明顯增多（P＜0.05）；與聯(lián)合藥物處理組比較

9、，VPA處理組和Liq處理組均明顯減少（P＜0.05），E2處理組顯著減少（P＜0.01）。
　　2、各組小鼠子宮形態(tài)及重量統(tǒng)計結(jié)果顯示：各藥物處理組小鼠子宮在外觀形態(tài)上均有不同程度的增大，統(tǒng)計分析結(jié)果得出，VPA組，Liq組與Control組相比，子宮重量無明顯變化（P＞0.05）;E2組，VPA+E2組，VPA+Liq與Control組相比，子宮重量顯著增加（P＜0.01）。E2組，VPA+E2組小鼠子宮形態(tài)與其余各組相比明顯

10、增生，重量也顯著增加（P＜0.05）,并有大小形狀不一的結(jié)節(jié)形成。3.蛋白水平實驗結(jié)果：
　?。?）雌激素受體α與β與生理鹽水組比較，大腦皮質(zhì)區(qū)ERα蛋白含量在聯(lián)合藥物處理組中顯著上升（P＜0.01），在各單獨藥物處理組中無明顯差異（P＞0.05）。與生理鹽水對照組相比，大腦海馬區(qū)ERα蛋白水平在VPA藥物處理組中無明顯變化（P＞0.05），在其余各藥物處理組中均顯著增多（P＜0.05）。在ERβ含量的比較中，與生理鹽水對照組相比

11、，其余各藥物處理組大腦皮質(zhì)及海馬區(qū)內(nèi) ERβ含量均顯著增多（P＜0.05），且聯(lián)合藥物處理組大腦皮質(zhì)及海馬區(qū)內(nèi)ERβ的含量比各藥物單獨處理組明顯增多（P＜0.05）。
　　（2）GSK-3β活性檢測：與生理鹽水對照組相比，其余各單獨藥物處理組小鼠腦皮質(zhì)及海馬區(qū)GSK-3β總蛋白水平均無明顯差異（P＞0.05），聯(lián)合藥物處理組腦皮質(zhì)區(qū)GSK-3β總蛋白水平顯著下降（P＜0.05），而腦海馬區(qū)內(nèi)GSK-3β總蛋白水平無明顯差異（P＞0

12、.05）。其第9位點磷酸化水平標志著GSK-3β活性的高低，與生理鹽水對照組相比，VPA組、E2組腦皮質(zhì)區(qū)pSer9-GSK-3β水平均無明顯差異（P＞0.05），Liq組及聯(lián)合藥物處理組腦皮質(zhì)區(qū)pSer9-GSK-3β水平明顯升高（P＜0.05）；而在各組腦海馬區(qū)pSer9-GSK-3β水平的比較中，與生理鹽水對照組相比，其余各藥物處理組pSer9-GSK-3β水平均明顯升高（P＜0.05），且與各單獨藥物處理組相比，聯(lián)合藥物處理組p

13、Ser9-GSK-3β水平也顯著升高（P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　1、卵巢切除手術(shù)后，AD小鼠體循環(huán)雌激素水平隨年齡增長呈下降趨勢，子宮形態(tài)隨年齡增長逐漸萎縮。
　　2、卵巢切除手術(shù)后，AD小鼠空間學習記憶能力隨年齡增長逐漸下降。
　　3、卵巢切除手術(shù)后，AD小鼠腦內(nèi)Aβ的沉積及老年斑的形成增多，其可能機制可能是與ERβ含量下降所導(dǎo)致的GSK-3β活性異常有關(guān)。
　　4、藥物處理明顯改善了去勢AD小鼠