羊口瘡病毒編碼的錨蛋白調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞NF-κB活化的作用研究.pdf

1、目的：病毒感染可引起宿主 NF-κB信號(hào)通路的活化，在天然免疫和炎癥反應(yīng)等抗病毒應(yīng)答過(guò)程中起著至關(guān)著重要的作用，研究證明痘病毒編碼的很多錨蛋白能抑制其活化而逃避宿主的免疫應(yīng)答。為了解析羊口瘡病毒（ORFV）編碼的錨蛋白在調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞NF-κB活化過(guò)程中的作用機(jī)制，初步探討 ORFV對(duì)宿主免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)及入侵宿主細(xì)胞的機(jī)制。
　　方法：首先，通過(guò)生物信息學(xué)方法初步預(yù)測(cè)ORFV錨蛋白結(jié)構(gòu)并分析其生物學(xué)特性和功能；其次，通過(guò)構(gòu)建其真核表

2、達(dá)載體，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，利用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)分析篩選對(duì) NF-κB信號(hào)活化有明顯調(diào)節(jié)作用的錨蛋白，再采用半定量RT-PCR和細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證篩選的錨蛋白的一些相關(guān)生物學(xué)特性和功能；最后，利用Western-blot方法檢測(cè)篩選的錨蛋白對(duì)NF-κB信號(hào)通路IκBα蛋白的總體水平及磷酸化水平的影響，以及對(duì)NF-κB p65蛋白核移位的作用。
　　結(jié)果：（1）生物學(xué)信息分析結(jié)果顯示，ORFV編碼的008、123、126、128和

3、129五種錨蛋白具有相似的特征：在N端均含有5～9個(gè)ANK基序序列，C末端的F-box-like結(jié)構(gòu)域序列與細(xì)胞內(nèi)的 F-box蛋白在關(guān)鍵位點(diǎn)的氨基酸（aa）基本一致，其中ORF126從第155位~177位aa區(qū)域?yàn)榭缒^(qū)，ORF128從第433位aa后的“PRRARRL”為核定位序列（NLS）；（2）RT-PCR結(jié)果表明，ORFV編碼的008、123、126、128和129五種錨蛋白均在病毒感染宿主細(xì)胞前期表達(dá)，細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)表明ORF

4、123錨蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)，ORF126錨蛋白定位于細(xì)胞線粒體，ORF128 NLS序列與ANK基序共同介導(dǎo)其編碼的錨蛋白定位于細(xì)胞核；（3）雙熒光素酶報(bào)告分析結(jié)果顯示ORF008、ORF123對(duì)NF-κB轉(zhuǎn)錄因子報(bào)告載體熒光素酶活性有極顯著的抑制作用(P<0.01)，ORF128也存在顯著的抑制作用(P<0.05)；（4）Western-blot結(jié)果說(shuō)明ORF008、ORF123能阻止經(jīng)TNF-α刺激NF-κB活化后IκBα蛋白磷酸化降