牛泡沫病毒通過活化細(xì)胞NF-κB信號通路促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄及復(fù)制.pdf

1、核因子κB,即NF-κB,是細(xì)胞中一類重要轉(zhuǎn)錄因子,在細(xì)胞生存、發(fā)育、分化以及免疫、炎癥反應(yīng)過程中參與基因的表達(dá)與調(diào)控。許多病毒也進(jìn)化出相應(yīng)的策略調(diào)節(jié)細(xì)胞的NF-κB信號通路,由此改變相關(guān)細(xì)胞事件,保證其完成生活周期。對相關(guān)現(xiàn)象及其中分子機(jī)制的解析是分子病毒學(xué)研究的重要內(nèi)容。本文對牛泡沫病毒(BFV)與宿主NF-κB信號通路間關(guān)系展開研究,發(fā)現(xiàn)BFV感染宿主細(xì)胞后,可通過其正調(diào)控蛋白BTas激活細(xì)胞NF-κB信號通路;NF-κB通路的活

2、化反過來又會增強(qiáng)BFV的轉(zhuǎn)錄,其中的Rel B作為BTas的轉(zhuǎn)錄輔因子完成正調(diào)控功能。這些發(fā)現(xiàn)為全面認(rèn)識反轉(zhuǎn)錄病毒與細(xì)胞NF-κB信號通路之間的關(guān)系提供了重要證據(jù)。相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如下：
　　 ⑴使用NF-κB報(bào)告基因系統(tǒng)以及p65細(xì)胞定位分析,發(fā)現(xiàn)BFV可以通過其反式激活因子BTas激活NF-κB信號通路；競爭抑制實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)IκBα和IKKβ參與BFV(BTas)激活NF-κB過程；使用IκBα磷酸化抗體檢測發(fā)現(xiàn)BFV(BTas)能

3、夠在體內(nèi)引起IκBα的磷酸化及后續(xù)降解。同時,我們還發(fā)現(xiàn)BTas除了能夠通過經(jīng)典途徑(IκBα的降解以及p65入核)激活NF-κB信號通路之外,還能通過誘導(dǎo)p100的剪切激活NF-κB替代途徑;免疫沉淀分析表明BTas能夠與IKKα和IKKβ在體內(nèi)相互作用。這些結(jié)果支持BTas通過與IKK復(fù)合物的相互作用調(diào)節(jié)其活性,進(jìn)而促進(jìn)IκBα的磷酸化,最終激活NF-κB信號通路。此外,我們使用BFV LTR報(bào)告基因系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)BTas介導(dǎo)的LTR轉(zhuǎn)錄

4、受到細(xì)胞NF-κB的正調(diào)控。
　　 ⑵對病毒利用NF-κB信號通路促進(jìn)自身復(fù)制相關(guān)分子機(jī)制的研究表明:BFVLTR沒有功能性κB位點(diǎn),表明細(xì)胞NF-κB效應(yīng)分子不能直接活化BFV的轉(zhuǎn)錄。但我室前期酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)提示BTas與NF-κB家族的RelB蛋白可能存在著相互作用。本文通過體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了兩者的相互作用,兩者的相互作用區(qū)域分別位于RelB的Rel同源域(RHD)以及BTas的C端一側(cè)；過表達(dá)及RNA干擾實(shí)驗(yàn)證實(shí)RelB

5、可以增強(qiáng)BTas介導(dǎo)的LTR轉(zhuǎn)錄,這一過程需要RelB與BTas在細(xì)胞核內(nèi)的相互作用以及RelB的轉(zhuǎn)錄激活域(TAD)。進(jìn)一步通過染色體免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)和EMSA實(shí)驗(yàn)證明在BFV復(fù)制過程中,細(xì)胞內(nèi)源的RelB蛋白可通過BTas介導(dǎo)間接結(jié)合在LTR之上,由此促進(jìn)BFV的轉(zhuǎn)錄及復(fù)制。上述結(jié)果表明BFV在復(fù)制過程中利用宿主細(xì)胞RelB蛋白作為其反式激活因子BTas的輔助因子,增強(qiáng)病毒基因的轉(zhuǎn)錄并最終促進(jìn)了病毒的復(fù)制。此外,我們還發(fā)現(xiàn)BFV(BT