骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)結(jié)腸癌進(jìn)展及AMPK-mTOR介導(dǎo)NF-κB信號通路對其調(diào)節(jié)作用.pdf

1、近年來MSC由于其在免疫調(diào)節(jié)、組織修復(fù)中的重要作用被投入臨床研究，而與此同時，MSC對腫瘤的作用也被人們所擔(dān)憂。其中MSC對結(jié)腸癌細(xì)胞的作用與相應(yīng)機制依然不清楚。
　　目的：
　　（1）闡明MSC上清對結(jié)腸癌細(xì)胞系生物學(xué)特性的影響。
　　（2）對相應(yīng)機制以及對結(jié)腸癌中重要的信號通路的影響進(jìn)行進(jìn)一步的研究。
　?。?）明確MSC上清對結(jié)腸癌細(xì)胞成瘤性的影響。
　　方法：
　?。?）以α-MEM做為對照，

2、使用MSC的24h上清（MSC-CM）刺激結(jié)腸癌細(xì)胞系后24h，使用MTT法檢測6d中結(jié)腸癌細(xì)胞系增殖的變化，使用BrdU、Ki67熒光染色的方法分別檢測結(jié)腸癌細(xì)胞S期與增殖期細(xì)胞的比例變化、JC-1測定結(jié)腸癌細(xì)胞線粒體膜電位的變化以及PI染色法確定細(xì)胞周期的變化，并同時使用Transwell檢測結(jié)腸癌細(xì)胞遷移能力的變化，在將MSC-CM與結(jié)腸癌細(xì)胞系混合后軟瓊脂半固體培養(yǎng)基與平板培養(yǎng)檢測克隆形成能力的變化。
　?。?）MSC-C

3、M刺激24h后，使用western blot（免疫印跡）檢測細(xì)胞周期相關(guān)蛋白P53、P16、P21的變化，同時使用QPCR檢測RNA水平的變化，隨后使用western blot、QPCR檢測凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、干性相關(guān)標(biāo)記物c-myc、OCT-4、Sox-2在蛋白與RNA水平的表達(dá)，同時使用ELISA檢測MSC-CM以及濃縮后的MSC-CM中IL-6、IL-8的表達(dá)。并同時使用QPCR與western blot確定MSC-C

4、M刺激24h后AMPK/mTOR通路以及NF-κB通路的變化，凝膠遷移實驗（EMSA）檢測NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的變化。
　?。?）將濃縮50倍的MSC-CM與結(jié)腸癌細(xì)胞系腹腔注射入Balb/c體內(nèi)，通過監(jiān)測小鼠體重、腫瘤轉(zhuǎn)移小鼠數(shù)量以及對小鼠腸免疫組化檢測HE、Ki67、E-Cadherin的變化。
　　結(jié)果：
　　（1）與對照培養(yǎng)基相比，MSC-CM刺激后的結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT-116與LOVO增殖明顯增加，同時 S期細(xì)

5、胞與增殖期細(xì)胞比例也有顯著增加。與此同時12h時結(jié)腸癌細(xì)胞遷移比率、14d后結(jié)腸癌細(xì)胞克隆形成數(shù)量、大小也明顯增加，結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡比率下降、細(xì)胞周期中G1期比例下降，S期與G2期上升。
　?。?）與對照培養(yǎng)基相比，MSC-CM刺激后結(jié)腸癌細(xì)胞系中的細(xì)胞周期、凋亡相關(guān)蛋白P53、Bax蛋白與RNA水平表達(dá)受到抑制，抑制凋亡蛋白Bcl-2在RNA水平表達(dá)上升，同時P21、P16表達(dá)也受到抑制，結(jié)腸癌細(xì)胞系干性基因c-myc、oct-

6、4、sox-2在RNA水平表達(dá)上升，c-myc、sox-2在蛋白水平的表達(dá)也有增加。與此同時，使用ELISA確認(rèn)了相對于HCT-116上清中IL-6：240±52.91(pg/ml)、IL-8：220±36.06(pg/ml)，MSC-CM中IL-6的表達(dá)達(dá)到1083.33±144.34(pg/ml)，IL-8達(dá)到733.33±104.08(pg/ml)，在MSC-CM處理后的上清中，IL-6達(dá)到1406.67±143.64(pg/ml

7、)，IL-8達(dá)到830±65.57(pg/ml)，而在50倍濃縮后的MSC-CM中，IL-6達(dá)到41700±1808.31(pg/ml)，IL-8達(dá)到29600±1967.23(pg/ml)。在檢測MSC-CM刺激后AMPK/mTOR與NF-κB通路的變化后發(fā)現(xiàn)AMPK磷酸化水平受到抑制，mTOR磷酸化水平上升，NF-κB通路中P65亞基磷酸化上升，抑制因子IKBα磷酸化降低，IKBα降解增加，同時NF-κB轉(zhuǎn)錄活性也得到增強。

8、　　(3)進(jìn)一步使用濃縮后的MSC-CM與HCT-116混合腹腔注射入 Balb/c小鼠，能夠得出小鼠體重下降、結(jié)腸成瘤數(shù)量上升，同時瘤體中HE、Ki67染色陽性細(xì)胞數(shù)目增加，E-Cadherin降低。
　　結(jié)論：
　　在MSC-CM的刺激下，結(jié)腸癌細(xì)胞系增殖、遷移、克隆形成能力增加、凋亡受到抑制，同時結(jié)腸癌細(xì)胞系細(xì)胞周期G1期比例下降、S期與G2期上升。細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)增高，而抑制凋亡蛋白比例下降，結(jié)腸癌細(xì)胞干性增強。