中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)P2X7受體在大鼠電針耐受中的作用.pdf

1、三磷酸腺苷（adenosine5'-triphosphate，ATP）是一種快速興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，與其受體結(jié)合后參與機體多種生理及病理機制的調(diào)節(jié)過程。目前，P2X受體已被克隆出P2X1~77種亞型。其中，P2X7受體由于其分子結(jié)構(gòu)的特殊性近年倍受關(guān)注。P2X7受體在體內(nèi)組織廣泛表達，與炎癥、腫瘤以及多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的機制有著密切關(guān)系。在疼痛相關(guān)機制的研究中發(fā)現(xiàn)，P2X7受體參與炎癥性疼痛、神經(jīng)病理性疼痛和癌性疼痛的調(diào)制機制。電針（elec

2、troacupuncture，EA）作為重要的非藥物鎮(zhèn)痛手段，廣泛應(yīng)用于臨床并取得良好的鎮(zhèn)痛效果。但長時間的使用外周穴位電針刺激其鎮(zhèn)痛作用會逐漸減弱，最終引起電針耐受（electroacupuncture tolerance）。近年來研究發(fā)現(xiàn)，P2X受體激活參與電針鎮(zhèn)痛及耐受機制。中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)( periaqueductal gray，PAG)為機體內(nèi)源性鎮(zhèn)痛系統(tǒng)的重要組成部分，尤其是其外側(cè)區(qū)（lateral periaquedu

3、ctal gray， lPAG）是疼痛信息調(diào)制和電針耐受形成、維持的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，但lPAG中P2X7受體激活是否參與電針耐受的形成和維持及其相關(guān)的信號機制尚不清楚。
　　目的：檢測多次外周穴位電針刺激后大鼠痛閾和lPAG中P2X7受體蛋白表達和功能變化，求證lPAG中P2X7受體活化后參與大鼠電針耐受的形成并對其相關(guān)的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制進行初步探討。
　　方法：本實驗包括兩個部分：（一）在體實驗：健康雄性 Sprague Daw

4、ley（SD）大鼠在外周穴位多次給予電針刺激，建立電針耐受大鼠模型；每日檢測大鼠痛閾值，觀察其變化規(guī)律；6 d后取各組大鼠lPAG，免疫組化、免疫印跡和免疫熒光雙標(biāo)法檢測P2X7受體在lPAG的表達部位及表達量變化情況；對電針耐受大鼠lPAG中微量注射不同劑量P2X7受體特異性拮抗劑A-740003，觀察其對大鼠痛閾和電針鎮(zhèn)痛作用的影響。（二）離體實驗：取<3 d的SD乳鼠lPAG組織，原代培養(yǎng)神經(jīng)元細胞，激光共聚焦檢測P2X7受體活化

5、對lPAG神經(jīng)元[Ca2+]i水平的影響。
　　結(jié)果：（一）在體實驗：假電針組大鼠在各觀察時間點機械痛閾變化值和熱痛閾變化
　　值以及l(fā)PAG中P2X7表達量與正常組大鼠比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；電針組大鼠痛閾變化值（包括機械痛閾變化值和熱痛閾變化值）與正常組比較顯著升高（P＜0.01），隨著電針刺激次數(shù)的增多其痛閾變化值逐漸下降，6次電針后趨近于正常組變化百分?jǐn)?shù)值（P＞0.05），提示：大鼠電針耐受形成；免疫

6、組化、免疫印跡技術(shù)檢測提示電針耐受大鼠lPAG中P2X7受體陽性細胞數(shù)和P2X7受體蛋白表達上調(diào)，與同時間點正常組大鼠比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）；通過對電針耐受大鼠lPAG微量注射10 nmol或100 nmol A-740003后，電針耐受大鼠機械痛閾及熱痛閾變化百分?jǐn)?shù)值增高，A-740003可翻轉(zhuǎn)電針耐受效應(yīng)；免疫熒光雙標(biāo)法檢測提示：P2X7受體與神經(jīng)元特異性標(biāo)記物NeuN在lPAG存在共表達，而與星形膠質(zhì)細胞特異性標(biāo)記

7、物GFAP及小膠質(zhì)細胞特異性標(biāo)記物 Iba1未見共表達。（二）離體實驗：激光共聚焦技術(shù)對[Ca2+]i水平檢測提示：P2X7受體激動劑BzATP可引起培養(yǎng)的lPAG神經(jīng)元細胞[Ca2+]i升高；給予P2X7受體特異性拮抗劑 A-740003或無鈣的細胞培養(yǎng)液分別預(yù)孵育10 min或20 min后，BzATP誘發(fā)的神經(jīng)元細胞[Ca2+]i升高被抑制。
　　結(jié)論：多次外周穴位電針刺激可引起正常大鼠痛閾變化百分?jǐn)?shù)降低，形成電針耐受；電針