P2X7受體介導(dǎo)2型糖尿病單核巨噬細胞免疫炎癥的調(diào)控作用研究.pdf

1、背景：糖尿?。―iabetes mellitus,DM）已成為世界第三大疾病，其發(fā)病率和對人類健康的危險性僅次于癌癥和心腦血管疾病。其中脂類代謝異常（如游離脂肪酸）在2型糖尿?。═ype2 diabetes mellitus,T2DM）的發(fā)病機制中具有重要作用，同時2型糖尿病也是一種低度炎癥性疾病。胰島素抵抗過程中的炎性反應(yīng)常引起機體異常炎癥因子的產(chǎn)生、急性期反應(yīng)蛋白的增加以及炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活。單核/巨噬細胞作為先天性免疫和適應(yīng)性

2、免疫的重要參與者，可通過分泌細胞因子及抗原提呈等作用影響并調(diào)控免疫炎癥反應(yīng)的進程。在炎癥狀態(tài)下，三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate，ATP）可從應(yīng)激細胞或死亡細胞中被動地釋放到細胞外，它通過與細胞膜上的相關(guān)嘌呤受體亞型（如P2X7受體）結(jié)合發(fā)揮不同的生理作用。P2X7受體是以ATP為配體的非選擇性陽離子門控通道，在多種炎性病理狀態(tài)下表達上調(diào)進而影響炎性介質(zhì)的釋放，參與炎性和免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)細胞損傷或凋亡等過程。長鏈非

3、編碼核糖核酸（long non-coding RNAs,lncRNAs）一般是指長度超過200個核苷酸、位于細胞核或胞漿內(nèi)、缺乏編碼蛋白質(zhì)的能力、以RNA形式在表觀遺傳水平、轉(zhuǎn)錄水平及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達的一種RNA。lncRNAs具有重要的生理學(xué)功能并參與某些疾病的病理變化過程。Uc.48+的長度為298bp，屬長鏈非編碼RNA。
　　研究證實在非糖尿病人群中，C反應(yīng)蛋白（C reactive protein,CRP）水平可以

4、預(yù)測2型糖尿病的發(fā)病，且其不受肥胖、脂肪分布和胰島素抵抗等因素的影響；同時CRP直接參與了炎癥及動脈粥樣硬化等心血管疾病，也是2型糖尿病并發(fā)的冠心病最強有力的預(yù)示因子與危險因子。脂類代謝異常可造成脂質(zhì)沉積或脂毒性而引起β細胞功能紊亂。雖然正常的脂肪酸(如磷脂)具有維持細胞膜完整性的作用，但如果游離脂肪酸濃度異常增加可誘導(dǎo)多種信號途徑（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、活性氧、凋亡、炎癥途徑等）功能異常出現(xiàn)脂毒性損傷。在炎癥狀態(tài)下，外周單核細胞進入組織分化形成

5、巨噬細胞。巨噬細胞可通過釋放一系列的生長因子和細胞因子而召集其它細胞（如纖維細胞、內(nèi)皮細胞等）影響相關(guān)組織的功能。2型糖尿病患者可誘導(dǎo)巨噬細胞產(chǎn)生炎性因子激活補體，同時誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞產(chǎn)生黏附因子，使內(nèi)皮功能受損，加速炎性反應(yīng)過程。P2X7受體廣泛表達于各種免疫細胞（如單核細胞、巨噬細胞、NK細胞等）中, P2X7受體激活后可增加免疫細胞分泌的炎性因子進而促進炎癥反應(yīng)的發(fā)生,同時可以調(diào)節(jié)B細胞及T細胞功能來調(diào)控免疫反應(yīng)。本研究第一部分將通過

6、觀察在高糖高脂處理下，P2X7受體介導(dǎo)的THP-1源性巨噬細胞炎癥反應(yīng)相關(guān)因子的改變，探討其在免疫炎癥反應(yīng)中的作用及可能機制。
　　在2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展過程中，巨噬細胞的炎癥反應(yīng)與脂質(zhì)代謝具有相互協(xié)同的特點，炎癥可導(dǎo)致脂質(zhì)代謝紊亂，脂質(zhì)代謝異常也可誘導(dǎo)炎癥的發(fā)生。研究表明巨噬細胞在炎癥反應(yīng)到組織修復(fù)轉(zhuǎn)換中扮演重要角色，可決定受傷部位的最終命運。LncRNAs具有組織特異性，在多種組織中均可表達，細胞分泌的lncRNAs常表現(xiàn)為疾

7、病、組織、發(fā)展階段等多方面特異性，此特征可使其成為生物標記物或治療靶點。LncRNAs表達異常與一些疾病的病理變化有關(guān)。本實驗觀察到高糖高脂處理導(dǎo)致巨噬細胞uc.48+表達上調(diào)，提示uc.48+涉及相關(guān)病理變化。目前尚未見uc.48+在單核巨噬細胞的研究報道。因此，本項研究第二部分將應(yīng)用lncRNA uc.48+siRNA對高糖高脂處理下RAW264.7巨噬細胞P2X7受體介導(dǎo)的糖尿病炎性病理損傷的影響，探討uc.48+在2型糖尿病巨噬

8、細胞P2X7受體介導(dǎo)免疫炎癥反應(yīng)中的作用及可能機制。
　　2型糖尿病狀態(tài)下，巨噬細胞的浸潤造成脂肪組織、肝臟、肌肉及胰腺均處于炎癥狀態(tài)。研究表明組織中的巨噬細胞狀態(tài)對2型糖尿病的發(fā)生及進展均具有關(guān)鍵性的調(diào)控作用。另一方面，特定組織中異常的lncRNAs表達可造成人體生物學(xué)功能紊亂從而引發(fā)各種疾病，如lncRNAs可能參與了胰島素的代謝效應(yīng)及胰島素抵抗的發(fā)展過程。本項研究第三部分將觀察lncRNA uc.48+siRNA對2型糖尿病

9、模型小鼠血糖血壓及神經(jīng)病理變化的影響及其對P2X7受體介導(dǎo)的腹腔巨噬細胞病理變化的影響，探討uc.48+在2型糖尿病小鼠及其腹腔巨噬細胞病理變化中的作用。
　　目的：
　　1、觀察2型糖尿病CRP正常組、2型糖尿病CRP升高組、正常對照組3組人群的臨床檢測指標、外周血單核細胞P2X7受體表達的差異。通過觀察在高糖高脂處理下，P2X7受體介導(dǎo)的THP-1源性巨噬細胞炎癥反應(yīng)相關(guān)因子的改變，探討其在免疫炎癥反應(yīng)中的作用及可能機制

10、。
　　2、觀察2型糖尿病CRP正常組、2型糖尿病CRP升高組、正常對照組3組人群血清uc.48+及細胞因子的變化。通過觀察lncRNA uc.48+小干擾RNA在高糖高脂處理下RAW264.7巨噬細胞P2X7受體介導(dǎo)炎性變化中的作用，探討uc.48+小干擾RNA對P2X7受體介導(dǎo)的免疫炎癥反應(yīng)的作用及可能機制。
　　3、通過觀察uc.48+siRNA對2型糖尿病模型小鼠及其腹腔巨噬細胞病理變化的影響，探討uc.48+在2型

11、糖尿病小鼠及P2X7受體介導(dǎo)的腹腔巨噬細胞炎性損傷中的作用。
　　方法：
　　1、選取2型糖尿病CRP正常組、2型糖尿病CRP升高組、正常對照組3組人群；臨床血樣檢測項目包括空腹血糖(FPG)、餐后血糖（PPG）、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、糖化血清蛋白（GSP）、空腹胰島素(FPI)；收集受檢者的EDTA抗凝血并通過流式細胞儀檢測外周血單核細胞P2X7受體的表達。統(tǒng)計

12、分析比較上述數(shù)據(jù)在3組人群中的差異。通過MTS檢測方法確定THP-1源性巨噬細胞的高糖高脂處理濃度；P2X7受體小干擾RNA(siRNA)干擾高糖高脂處理下的THP-1源性巨噬細胞，通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)（RT-PCR）方法和蛋白印跡方法分別檢測P2X7受體mRNA和蛋白的表達；通過熒光探針檢測細胞內(nèi)活性氧及鈣濃度；采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定培養(yǎng)上清液細胞因子的含量，包括腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素-10(IL-1

13、0)、白介素-1β(IL-1β)；蛋白印跡法檢測ERK信號通路的改變。
　　2、采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定2型糖尿病CRP正常組、2型糖尿病CRP升高組、正常對照組3組人群血清細胞因子的含量，包括腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素-10(IL-10)、白介素-1β(IL-1β)；采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)檢測血清中uc.48+的表達；Uc.48+小干擾RNA(siRNA)干擾高糖高脂處理下的RAW264.7細胞，通過R

14、T-PCR方法檢測uc.48+的表達、P2X7受體mRNA的表達；蛋白印跡法檢測P2X7受體蛋白及ERK信號通路的改變。通過熒光探針檢測細胞內(nèi)活性氧及鈣濃度；采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定培養(yǎng)上清液細胞因子的含量，包括腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素-10(IL-10)、白介素-1β(IL-1β)；通過MTS試驗和流式細胞儀分別檢測細胞增殖活性和細胞凋亡水平。
　　3、高糖高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合小劑量STZ腹腔注射誘導(dǎo)2型糖尿

15、病小鼠模型，血糖檢測確定2型糖尿病小鼠模型是否成功建模；uc.48+小干擾RNA腹腔皮下注射后，檢測小鼠血清中的血脂和細胞因子濃度，檢測小鼠的血壓和心率、機械痛敏閾值和熱痛敏閾值；獲取并鑒定小鼠腹腔巨噬細胞后，通過calcein-AM和YO-PRO染料檢測P2X7受體通道的形成；通過RT-PCR方法檢測uc.48+的表達、P2X7受體mRNA的表達；蛋白印跡法檢測P2X7受體蛋白及ERK信號通路的改變。
　　結(jié)果：
　　1、

16、2型糖尿病組在空腹血糖、餐后血糖、糖化血清蛋白、穩(wěn)態(tài)模型評估胰島素抵抗指數(shù)及甘油三酯、膽固醇、低密度脂蛋白均明顯高于正常對照組，而2型糖尿病CRP升高組在CRP、空腹胰島素、穩(wěn)態(tài)模型評估胰島素抵抗指數(shù)及糖化血清蛋白均明顯高于其他2組。2型糖尿病CRP升高組單核細胞P2X7受體的表達明顯高于2型糖尿病CRP正常組和正常對照組。通過MTS試驗確定高糖高脂處理THP-1巨噬細胞的濃度為44.4mM葡萄糖合并1.0mM游離脂肪酸；高糖高脂處理后

17、THP-1巨噬細胞P2X7受體的mRNA及蛋白表達較對照組顯著增加；P2X7 siRNA轉(zhuǎn)染可顯著抑制P2X7 mRNA及蛋白的表達。P2X7 siRNA轉(zhuǎn)染可顯著降低因高糖高脂處理而升高的THP-1巨噬細胞內(nèi)活性氧及鈣濃度；P2X7 siRNA轉(zhuǎn)染可顯著降低因高糖高脂處理而升高的THP-1巨噬細胞TNF-α、IL-1β含量，P2X7 siRNA轉(zhuǎn)染可顯著提高因高糖高脂處理而降低的IL-10濃度；P2X7 siRNA轉(zhuǎn)染可顯著降低因高糖

18、高脂處理而升高的THP-1巨噬細胞p-ERK1/2的蛋白激活水平。
　　2、2型糖尿病患者的TNF-α、IL-1β的水平明顯高于正常對照組，同時TNF-α及IL-1β的水平在2型糖尿病CRP升高組明顯高于2型糖尿病CRP正常組；IL-10在2型糖尿病CRP升高組的水平顯著低于其他2組。2型糖尿病患者血清uc.48+的表達水平較正常對照組顯著增加，uc.48+在2型糖尿病CRP升高組的表達明顯高于2型糖尿病CRP正常組。uc.48+

19、siRNA處理降低了高糖高脂誘導(dǎo)下RAW264.7細胞uc.48+的表達；uc.48+siRNA轉(zhuǎn)染可顯著降低因高糖高脂處理而升高的RAW264.7細胞P2X7受體mRNA和蛋白的表達。uc.48+siRNA轉(zhuǎn)染可顯著提高因高糖高脂處理而降低的RAW264.7細胞增殖水平，uc.48+siRNA轉(zhuǎn)染可顯著降低因高糖高脂處理而升高的RAW264.7細胞凋亡水平。uc.48+siRNA轉(zhuǎn)染可顯著降低因高糖高脂處理而升高的RAW264.7細胞

20、內(nèi)活性氧及鈣濃度。uc.48+siRNA轉(zhuǎn)染可顯著降低因高糖高脂處理而升高的RAW264.7細胞TNF-α、IL-1β含量，uc.48+siRNA轉(zhuǎn)染可顯著提高因高糖高脂處理而降低的IL-10濃度；uc.48+ siRNA轉(zhuǎn)染可顯著降低因高糖高脂處理而升高的 RAW264.7細胞p-ERK1/2的蛋白激活水平。
　　3、高糖高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合小劑量STZ腹腔注射誘導(dǎo)2型糖尿病小鼠模型，小鼠空腹血糖及餐后血糖均較對照組顯著升高，提示2

21、型糖尿病模型制作成功；給予uc.48+siRNA注射后其空腹血糖及餐后血糖均較模型組顯著下降。模型組、小干擾對照組及uc.48+小干擾組的血脂較對照組顯著增加，但模型組、小干擾對照組及uc.48+小干擾組之間血脂比較無顯著性差異；模型組小鼠較對照組的機械縮足反射閾值及熱縮足反射閾值均明顯降低，給予uc.48+siRNA注射后，其機械縮足反射閾值及熱縮足反射閾值均較模型組反射閾值顯著增加；模型組的小鼠心率較對照組顯著增加，但給予uc.48

22、+siRNA注射后，模型組、干擾對照組及uc.48+小干擾組之間心率比較無顯著性差異；模型組的小鼠收縮壓及舒張壓均較對照組顯著增加，給予uc.48+siRNA注射后，其收縮壓及舒張壓均較模型組顯著下降；模型組TNF-α、IL-1β的含量較正常組顯著增加，而uc.48+siRNA注射后，其TNF-α、IL-1β的濃度顯著下降；模型組IL-10濃度較正常組明顯降低，而uc.48+siRNA注射后，其IL-10濃度顯著升高。模型組小鼠腹腔巨噬

23、細胞P2X7受體離子通道的形成、P2X7的mRNA及蛋白表達及p-ERK1/2的蛋白激活水平均明顯高于對照組；而uc.48+siRNA注射后可顯著降低P2X7受體離子通道的形成、P2X7的mRNA及蛋白表達及p-ERK1/2的蛋白激活水平。
　　結(jié)論：
　　1、2型糖尿病CRP升高組外周血單核細胞的P2X7受體的表達升高可能與胰島素抵抗的形成有關(guān)。高糖高脂作用THP-1源性巨噬細胞，其P2X7受體的表達、炎癥因子的釋放及p-

24、ERK信號通路的激活均可出現(xiàn)上調(diào)，而降低P2X7受體的表達，可抑制或改善其介導(dǎo)的炎癥狀態(tài)，揭示P2X7受體可調(diào)控THP-1源性巨噬細胞的炎癥反應(yīng)。
　　2、2型糖尿病CRP升高組患者處于免疫炎癥狀態(tài)，其血清uc.48+的表達、CRP含量及炎癥因子水平增加。高糖高脂刺激RAW264.7細胞uc.48+表達增加，并可導(dǎo)致多種途徑（如分泌細胞因子、產(chǎn)生活性氧、激活ERK信號通路等）功能異常，而uc.48+小干擾RNA可降低RAW264.

25、7細胞P2X7受體的上調(diào)表達，進而影響P2X7受體介導(dǎo)的免疫炎癥反應(yīng)。
　　3、2型糖尿病小鼠腹腔巨噬細胞uc.48+的表達增加，uc.48+小干擾RNA影響2型糖尿病小鼠血糖血壓及神經(jīng)病理變化，降低2型糖尿病小鼠腹腔巨噬細胞P2X7受體的上調(diào)表達，并對2型糖尿病小鼠腹腔巨噬細胞P2X7受體介導(dǎo)的炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)及ERK信號通路具有調(diào)控作用，提示uc.48+通過下調(diào)P2X7受體表達影響2型糖尿病小鼠血糖血壓、神經(jīng)病理變化及腹