P2X7受體在大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后繼發(fā)性損傷中的作用及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　蛛網(wǎng)膜下腔出血(Subarachnoid hemorrhage，SAH)是一種嚴(yán)重威脅人類健康的神經(jīng)外科急危重癥，約占全部腦卒中的5％～10％，其中85％的出血原因?yàn)轱B內(nèi)動脈瘤破裂。盡管診斷方法、血管介入、手術(shù)夾閉、以及圍手術(shù)期處理等臨床手段較前取得了巨大的進(jìn)步，大大降低了動脈瘤破裂再出血的發(fā)生率，但SAH的致死率和致殘率未獲得明顯降低，其對社會經(jīng)濟(jì)造成的負(fù)擔(dān)巨大。過去四十年來，腦血管痙攣一直被認(rèn)為是導(dǎo)致高死亡和高

2、致殘的主要因素，可惜，針對腦血管痙攣的治療臨床上并未獲得成功。近期越來越多的證據(jù)提示:腦血管痙攣可能只是SAH的病理因素之一，甚至可能僅僅只是SAH后期的臨床表現(xiàn)。事實(shí)上，多種腦損傷機(jī)制共同參與了SAH的病理生理過程，包括早期腦損傷(Early brain injury，EBI)，皮層去極化和微循環(huán)障礙等。它們相互作用，共同導(dǎo)致了SAH災(zāi)難性的結(jié)局。其中，國際卒中學(xué)術(shù)界已經(jīng)逐漸接受了EBI是SAH致死致殘的主要原因。
　　新概念E

3、BI指從SAH后72小時(shí)以內(nèi)發(fā)生的一系列腦損傷。目前，對EBI病理生理機(jī)制已有了初步的認(rèn)識，主要包括動脈瘤破裂后的機(jī)械性損傷、顱內(nèi)壓升高、腦血流量降低、腦灌注壓下降、大腦皮質(zhì)的廣泛去極化、細(xì)胞凋亡和壞死、自噬作用、離子穩(wěn)態(tài)的破壞、炎癥反應(yīng)、血腦屏障破壞、及腦水腫等，但具體的損傷機(jī)制及信號通路需要進(jìn)一步的探索研究。
　　炎癥反應(yīng)和神經(jīng)元凋亡是EBI機(jī)制研究的熱點(diǎn)。多種炎癥通路已在SAH后EBI中激活。SAH患者血液及腦脊液中的炎癥因

4、子水平與患者的損傷程度及預(yù)后密切相關(guān)。白介素1β(Interleukin-1β，IL-1β)是參與EBI的主要炎癥因子，但其在SAH腦內(nèi)準(zhǔn)確的來源及具體的生成釋放機(jī)制仍不清楚。Cryopyrin炎癥小體能夠識別來自病原相關(guān)分子模式或者宿主來源的危險(xiǎn)信號分子的信號，招募促炎癥蛋白酶caspase-1并致其自我激活。活化的caspase-1切割I(lǐng)L-1β和IL-18的前體，產(chǎn)生成熟IL-1β和IL-18。P2X7受體(P2X7 recept

5、or, P2X7R)是cryopyrin炎癥小體的上游分子。P2X7R激活導(dǎo)致的K+外流是cryopyrin炎癥小體激活的主要機(jī)制之一。目前，尚無P2X7R和cryopyrin炎癥小體在SAH中臨床和實(shí)驗(yàn)研究。
　　SAH發(fā)生后，腦內(nèi)廣泛區(qū)域神經(jīng)元發(fā)生凋亡，并導(dǎo)致腦損傷。動物實(shí)驗(yàn)已證實(shí):減少神經(jīng)元凋亡可以明顯改善SAH造成的神經(jīng)功能損傷。促凋亡因子和抗凋亡因子及其上游信號通路共同參與了SAH后凋亡反應(yīng)的整個(gè)過程。其中，活化的cas

6、pase-3是誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的核心，也是凋亡反應(yīng)的真正執(zhí)行者。抑制caspase-3的激活對治療SAH至關(guān)重要。前期研究發(fā)現(xiàn):P2X7R可以調(diào)控caspase-3的活性。因此，本課題推測阻斷P2X7R的激活可以緩解SAH后神經(jīng)元的凋亡，從而改善SAH后的神經(jīng)功能，并探索其中相應(yīng)的病理機(jī)制。
　　SAH能夠引起全身炎癥反應(yīng)綜合征，并發(fā)急性多器官功能障礙，表現(xiàn)為心臟驟停，肺、腎等臟器損傷，和胃腸反應(yīng)等。神經(jīng)源性肺水腫增加SAH患者的死

7、亡率，但是，其發(fā)生具體的機(jī)制和治療手段尚不明確。目前，全身炎癥反應(yīng)和肺血管壓力升高是兩種可能的主要機(jī)制。P2X7R在肺組織的多種細(xì)胞膜上廣泛表達(dá)，并于炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，因此，本課題推測P2X7R可能參與了SAH引發(fā)的神經(jīng)源性肺水腫(Neurogenicpulmonary edema，NPE)，目前國內(nèi)外尚未開展相關(guān)研究。
　　近年來，研究提示P2X7R參與多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)展過程，作用廣泛而且非常重要。本研究擬在前期工作基礎(chǔ)

8、上，探索P2X7R阻斷劑能否減輕SAH后EBI和非神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，其保護(hù)作用是否與抗炎，抗凋亡和緩解NPE有關(guān)。
　　1.P2X7R/Cryopyrin炎癥小體在蛛網(wǎng)膜下腔出血后炎癥發(fā)生中的作用
　　研究目的：
　　本部分實(shí)驗(yàn)檢測大鼠SAH后P2X7受體，cryopyrin炎癥小體的組件(cryopyrin，apoptosis-associated speck-like protein containing a CAR

9、D(ASC)，caspase-1前體）及下游的炎癥因子的表達(dá)，包括成熟IL-1β和IL-18;了解P2X7R/cryopyrin炎癥小體信號通路在SAH炎癥反應(yīng)中的作用，并進(jìn)一步闡明炎癥對SAH神經(jīng)功能的影響，為探索抑制SAH炎癥的破壞作用開拓新思路和提供必要的理論依據(jù)。
　　研究方法：
　　根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，該部分研究分四部分:
　　(1)建立大鼠SAH血管內(nèi)穿刺模型，觀察SAH后72h內(nèi)P2X7R/cryopyr

10、in炎癥小體通路隨時(shí)間的變化趨勢及其是否在小膠質(zhì)細(xì)胞上表達(dá)。應(yīng)用Western Blot方法檢測P2X7R，cryopyrin分子及其下游主要的炎癥因子IL-1β在SAH后2h，6h，24h，48h和72h的表達(dá)情況。應(yīng)用免疫熒光技術(shù)觀察P2X7R和cryopyrin炎癥小體分別與小膠質(zhì)細(xì)胞共定位的情況。
　　(2)該部分實(shí)驗(yàn)分為sham，SAH+Vehicle（生理鹽水，腦室注射），SAH+scramble smallinter

11、fering RNA（siRNA），SAH+P2X7R siRNA和SAH+cryopyrin siRNA。 SAH建模前24h，左側(cè)腦室注射P2X7R siRNA和cryopyrin siRNA基因敲除相應(yīng)分子。采用改良Garcia評分綜合平衡木試驗(yàn)評估大鼠SAH的神經(jīng)功能，干濕重法測量腦水腫及WesternBlot檢測相應(yīng)的下游分子水平，包括:P2X7R，cryopyrin，活化caspase-1，成熟的IL-1β和成熟的IL-18

12、。
　　(3)該實(shí)驗(yàn)分為Naive，Naive+Lipopolysaccharide(LPS)，Naive+LPS+Benzoyl benzoylATP(BzATP),Naive+LPS+BzATP+scramble siRNA，和Na(i)ve+LPS+BzATP+cryopyrinsiRNA。側(cè)腦室注射內(nèi)毒素LPS建立大鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥模型。在該模型上，LPS注射前21h腦室注射scramble siRNA或cryopyr

13、in siRNA，LPS注射后3h腦室注射P2X7R的激動劑BzATP。 Western Blot檢測cryopyrin，活化caspase-1，成熟的IL-1β的表達(dá)，確定大鼠腦內(nèi)P2X7R和cryopyrin炎癥小體之間的關(guān)系。
　　(4)該研究內(nèi)容分為sham，SAH+vehicle，SAH+brilliant blue G（BBG，5mg/kg），SAH+BBG（30mg/kg），SAH+BBG(100mg/kg)五組，選

14、取SAH后24h和72h作為觀察的時(shí)間點(diǎn)，采用改良的Garcia評分和平衡試驗(yàn)評估大鼠SAH的行為學(xué)，干濕重法測量腦水腫，Western Blot檢測相應(yīng)的下游分子水平改變，包括P2X7R，活化的caspase-1，成熟的IL-1β/IL-18和myeloperoxidase(MPO)，免疫熒光技術(shù)檢測MPO以觀察SAH后中性粒細(xì)胞的浸潤情況。
　　研究結(jié)果：
　　(1)本組研究發(fā)現(xiàn)SAH后72h內(nèi)，cryopyrin和成熟

15、的IL-1β的表達(dá)在24h時(shí)達(dá)到高峰，而P2X7R的水平并沒有明顯的改變。Cryopyrin和P2X7R分別小膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物為離子鈣接頭分子(Ionized calcium bindingadaptor molecule-1，Iba-1)共熒光定位，提示上述分子在小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。
　　(2)在SAH后24h，相比vehicle和scramble siRNA，P2X7R siRNA和cryopyrin siRNA降低下游炎癥分子

16、活化caspase-1，成熟IL-1β及IL-18的表達(dá);緩解SAH后腦水腫和改善的大鼠的神經(jīng)功能評分。
　　(3)在LPS誘導(dǎo)的大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥模型中，P2X7R的激動劑BzATP明顯增加下游炎癥因子:活化caspase-1和成熟IL-1β的水平。Cryopyrin siRNA能夠消除BzATP的促炎癥作用。
　　(4)中劑量BBG(30mg/kg)緩解SAH后的腦水腫，改善神經(jīng)功能評分，這種神經(jīng)功能保護(hù)作用可能與減少

17、炎癥因子:激活的caspase-1，成熟IL-1β/IL-18的表達(dá)有關(guān)。此外，BBG阻滯中性粒細(xì)胞向腦組織的浸潤。
　　研究結(jié)論：
　　SAH后，P2X7受體/cryopyrin炎癥小體信號通路激活caspase-1/IL-1β/IL-18，導(dǎo)致EBI中炎癥發(fā)生，該通路是調(diào)控SAH炎癥反應(yīng)發(fā)生的新機(jī)制，針對P2X7R/cryopyrin炎癥小體信號通路為此后的SAH的治療開拓新思路和提供必要理論依據(jù)。
　　2.P2X

18、7R阻斷劑抑制蛛網(wǎng)膜下腔出血早期神經(jīng)元凋亡的機(jī)制研究
　　研究目的：
　　本課題試圖闡明大鼠SAH后P2X7R在神經(jīng)元凋亡中的作用，并探索該作用的具體信號機(jī)制，探索P2X7R/P38絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路在SAH后神經(jīng)元凋亡中的作用，從而進(jìn)一步闡明凋亡在SAH后EBI中的影響，并為探索抑制SAH后神經(jīng)元凋亡開拓新的研究思路。
　　研究方

19、法：
　　根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，該部分研究分兩部分:
　　(1)該實(shí)驗(yàn)分為sham，SAH+Vehicle，SAH+BBG和SAH+BBG+BzATP。SAH建模成功后30 min，于腹腔給予BBG或相應(yīng)等體積的Vehicle（生理鹽水）。P2X7R的激動劑BzATP于SAH建模前3h腦室注射。采用改良的Garcia評分和平衡木試驗(yàn)分別評估SAH大鼠的行為學(xué);干濕重法測量腦水腫及Western Blot檢測相應(yīng)的下游分子水平改

20、變，包括:P2X7R，磷酸化P38 MAPK蛋白，Bcl-2及成熟caspase-3蛋白。免疫熒光雙染共定位P2X7R和神經(jīng)元細(xì)胞核(neuronal nuclei，NeuN)用來檢測該受體在神經(jīng)元上的表達(dá)分布情況。Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated uridine5'-triphosphate-biotinnick end-labeling(TUNEL)染色觀察SAH后神經(jīng)元凋

21、亡情況。
　　(2)該實(shí)驗(yàn)分為sham，SAH+Vehicle，SAH+scramble siRNA和SAH+P2X7R siRNA。SAH建模前24h，通過腦室注射P2X7R siRNA敲除相應(yīng)P2X7R，采用改良的Garcia評分和平衡木試驗(yàn)分別評估SAH大鼠的行為學(xué)，Western Blot檢測相應(yīng)的下游分子水平改變，包括P2X7R，磷酸化P38 MAPK蛋白及成熟caspase-3蛋白。
　　研究結(jié)果：
　　(

22、1)本組研究發(fā)現(xiàn)SAH后24h，P2X7R在神經(jīng)元的細(xì)胞膜上表達(dá)。
　　(2) Western blot顯示30mg/kgBBG明顯減少SAH后24h P38 MAPK磷酸化水平的表達(dá)，降低成熟caspase-3的表達(dá)水平，相反，增加抗凋亡因子Bcl-2的表達(dá)。TUNEL染色顯示BBG明顯減少SAH造成的神經(jīng)元凋亡。
　　(3)相比vehicle和scramble siRNA，P2X7R siRNA明顯減少SAH后24h磷酸

23、化P38MAPK的表達(dá)，降低成熟caspase-3的表達(dá)水平，改善SAH后的神經(jīng)功能。
　　研究結(jié)論：
　　P2X7R參與SAH后EBI中神經(jīng)元凋亡。P2X7R抑制劑降低SAH后磷酸化P38MAPK的表達(dá)，減少成熟caspase-3的表達(dá)，最終，緩解神經(jīng)元凋亡并改善大鼠神經(jīng)功能。該研究闡明了P2X7R作為EBI中凋亡的新機(jī)制，為后續(xù)的SAH的抗凋亡治療開拓新思路和提供必要理論依據(jù)。
　　3.P2X7R阻斷劑抑制蛛網(wǎng)膜下

24、腔出血后神經(jīng)源性肺損傷的機(jī)制研究
　　研究目的：
　　本部分研究試圖闡明大鼠SAH后P2X7R在SAH后NPE中的作用，該受體阻斷劑能否通過其抗炎作用緩解NPE的癥狀，從而進(jìn)一步闡明炎癥在SAH后NPE中的作用，并為探索治療SAH引起的NPE開拓新的研究思路。
　　研究方法：
　　該實(shí)驗(yàn)分為sham，SAH+Vehicle，SAH+BBG。SAH建模成功后30 min，于腹腔給予BBG（30mg/kg）或相應(yīng)等體

25、積的Vehicle（生理鹽水）。觀察NPE相關(guān)癥狀的發(fā)生率，測量大鼠的體重及肺濕重，Western Blot檢測肺葉中相應(yīng)的炎癥分子:成熟IL-1β和MPO的改變和緊密連接蛋白:zonula occludens-1(ZO-1)和occludin。明膠酶譜檢測肺組織內(nèi)matrix metaltopeptidase-9（MMP-9）的活性。P2X7R和I型肺泡上皮細(xì)胞（T1-α）進(jìn)行免疫熒光雙染。Hemotoxylin-eosin(HE)染

26、色比較上述三組肺損傷的情況。
　　研究結(jié)果：
　　(1)本組研究發(fā)現(xiàn)SAH后24h，P2X7R在I型肺泡上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜上表達(dá)。
　　(2)大鼠SAH后NPE相關(guān)癥狀的發(fā)生率與P指數(shù)相一致。
　　(3) BBG減少SAH后24h肺葉組織中成熟IL-1β和MPO的水平，抑制MMP-9的活化，增加緊密連接蛋白ZO-1和occludin的水平。HE染色顯示BBG明顯緩解SAH后肺組織損傷程度。
　　研究結(jié)論：