針刺誘導(dǎo)神經(jīng)環(huán)路激活及中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)基因差異表達(dá)研究.pdf

1、電針(Electroacupuncture,EA)是一種治療疼痛的有效方法。通過傳統(tǒng)物理和藥理學(xué)手段已經(jīng)確定許多參與針刺鎮(zhèn)痛的神經(jīng)核團(tuán)和區(qū)域,但單個(gè)核團(tuán)或區(qū)域并不能闡明針刺鎮(zhèn)痛的神經(jīng)機(jī)制,針刺鎮(zhèn)痛激活的神經(jīng)環(huán)路還有待研究。大量的研究表明電針可以誘導(dǎo)多種鎮(zhèn)痛物質(zhì)(如腦啡肽、內(nèi)啡肽、強(qiáng)啡肽等)和抗鎮(zhèn)痛物質(zhì)(如膽囊收縮素、孤啡肽、血管緊張素Ⅱ等)的釋放。顯然,針刺鎮(zhèn)痛是中樞多種物質(zhì)共同作用的綜合表現(xiàn)。由于在不同神經(jīng)核團(tuán)中神經(jīng)元功能各異,神經(jīng)元

2、內(nèi)信號分子參與調(diào)節(jié)針刺鎮(zhèn)痛的機(jī)制還不清楚。因此,本研究旨在探索針刺鎮(zhèn)痛的相關(guān)神經(jīng)環(huán)路、物質(zhì)及分子信號通路。
　　1.針刺不同穴位激活的共同神經(jīng)環(huán)路
　　為探索針刺鎮(zhèn)痛的相關(guān)神經(jīng)環(huán)路,本研究通過標(biāo)記激活的神經(jīng)元,比較分析針刺不同穴位激活的中樞神經(jīng)核團(tuán)或區(qū)域。選取28只雜交雄性山羊(30±2kg),隨機(jī)分為四組:空白對照組,“百會-三臺”假針組,“百會-三臺”電針組,雙側(cè)后三里電針組。電針組山羊電針1次(60Hz,30min);

3、對照組山羊僅做保定處理;假針組山羊只扎針、不通電。采用鉀離子透入法測定山羊痛閾。記錄電針前后的山羊痛閾值,計(jì)算痛閾變化率。待測痛后山羊迅速處死,采取大腦和脊髓組織樣。采用免疫酶組織化學(xué)方法檢測尾核、伏核、外側(cè)隔區(qū)、內(nèi)側(cè)隔區(qū)、下丘腦室旁核、下丘腦腹內(nèi)側(cè)核、弓狀核、基底杏仁核、僵核、臂旁核、藍(lán)斑、孤束核、垂體、中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)腹外側(cè)(vlPAG)、中縫大核(NRM)、巨細(xì)胞網(wǎng)狀核(Gi)和脊髓背角(SCDH)中c-Fos蛋白表達(dá)水平。

4、r>　　試驗(yàn)結(jié)果顯示,“百會-三臺”和后三里電針組山羊痛閾在電針后顯著升高(p＜0.05)。“百會-三臺”電針組山羊的痛閾變化率顯著高于后三里電針組(p＜0.05)。與空白組相比,電針后三里或“百會-三臺”組穴都能誘導(dǎo)c-Fos免疫樣陽性神經(jīng)元在內(nèi)側(cè)隔區(qū)、下丘腦腹內(nèi)側(cè)核、弓狀核、基底杏仁核、韁核、垂體前葉、臂旁核、藍(lán)斑、vlPAG、NRM、Gi和SCDH內(nèi)顯著增加(p＜0.05)。與后三里電針組相比,電針“百會-三臺”組穴誘導(dǎo)c-Fos

5、免疫樣陽性神經(jīng)元在基底杏仁核內(nèi)顯著增加(p＜0.05),但在內(nèi)側(cè)隔區(qū)、下丘腦室旁核、韁核和SCDH內(nèi)顯著減少(p＜0.05)。這些結(jié)果提示弓狀核-中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)-中縫大核/藍(lán)斑-脊髓背角和下丘腦-垂體是電針不同穴位激活的共同神經(jīng)環(huán)路。
　　2.電針山羊中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)基因差異表達(dá)
　　為全面了解電針對中樞神經(jīng)系統(tǒng)基因表達(dá)的影響,本研究采取電針山羊PAG進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組高通量深度測序,運(yùn)用qPCR方法對測序結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證,并通過

6、側(cè)腦室微注射技術(shù)進(jìn)一步研究差異基因胸腺素β4在電針鎮(zhèn)痛中的作用。選取三對純種波爾山羊(30±2kg),按照配對試驗(yàn)方法進(jìn)行同窩配對,每對山羊中一只接受電針為電針組,另一只接受對照處理為對照組。電針組山羊接受1次電針(60Hz,30min)。采用鉀離子透入法測定山羊痛閾。記錄電針前和電針0h和4h后的山羊痛閾,計(jì)算痛閾變化率。在4h測完痛閾后,6只山羊迅速處死,取PAG分別進(jìn)行測序建庫。利用生物信息學(xué)方法對電針組與對照組的差異表達(dá)基因進(jìn)行

7、功能富集分析。在qPCR驗(yàn)證試驗(yàn)中,選取測序結(jié)果中表達(dá)量高的15個(gè)差異基因進(jìn)行驗(yàn)證。選取差異基因胸腺素β4進(jìn)行進(jìn)一步研究。在探索胸腺素β4(Tβ4)在電針鎮(zhèn)痛中的作用試驗(yàn)中,分別建立生理模型和炎癥模型進(jìn)行側(cè)腦室注射。在生理模型試驗(yàn)中,選取72只SD大鼠(250±20g)隨機(jī)分為兩組(n=36),即電針組與對照組,各組大鼠分別接受側(cè)腦室注射1μg/μL Tβ4、0.1μg/μL Tβ4、0.01μg/μL Tβ4、Lip-Tβ4-siRN

8、A(Tβ4沉默用siRNA)、Lip-C-siRNA(negative siRNA)或PBS(每6只大鼠注射同一種藥物)。注射后,電針組大鼠接受1次電針。每組大鼠注射前和電針后測定鼠甩尾反射時(shí)間(TFL),計(jì)算TFL變化率。在炎癥模型試驗(yàn)中,選取54只SD大鼠(250±20g)隨機(jī)分為三組,即炎癥電針組(CFA+EA,n=24)、炎癥對照組(CFA+CON,n=24)和生理對照組(Saline+CON,n=6)。CFA+EA或CFA+C

9、ON組大鼠足底注射CFA(0.1mL/只),各組大鼠分別接受側(cè)腦室注射0.1μg/μL Tβ4、Lip-Tβ4-siRNA、Lip-C-siRNA或PBS注射(每6只大鼠注射同一種藥物)。生理對照組大鼠足底注射生理鹽水(0.1mL/只),側(cè)腦室注射PBS。CFA+EA組分別于0d、2d、4d、6d、8d、10d和13d施予電針。所有大鼠于足底注射藥物前和注射后1d、3d、7d、14d測定足底機(jī)械痛閩(PWT),計(jì)算PWT痛閾變化率。

10、r>　　結(jié)果顯示,電針后電針組山羊痛閾顯著高于對照組山羊痛閾(p＜0.05)。測序分析得到2651個(gè)差異表達(dá)基因(DEGs),其中1709個(gè)基因上調(diào),852個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。這些差異基因富集在30條KEGG pathways和149條GO terms。進(jìn)一步qPCR驗(yàn)證結(jié)果顯示,甲硫腦啡肽、阿黑皮素原、前強(qiáng)啡肽原、κ-阿片肽受體、谷氨酸受體、興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體1、γ氨基丁酸B型受體、酸性纖維蛋白、芳香族氨基酸脫羧酶、突觸結(jié)合蛋白1、安定綁

11、定蛋白、前蛋白轉(zhuǎn)換酶1抑制劑、胸腺素β4、胸腺素β10和前列腺F合酶基因的表達(dá)趨勢與高通量測序結(jié)果一致,驗(yàn)證了測序結(jié)果的可靠性。測序結(jié)果提示,電針上調(diào)的谷氨酸受體及轉(zhuǎn)運(yùn)體、γ氨基丁酸受體及轉(zhuǎn)運(yùn)體、絲裂原激活的蛋白激酶、突觸結(jié)合蛋白可能通過谷氨酸能突觸、γ氨基丁酸能突觸、MAPK、核糖體、泛素蛋白體等途徑參與調(diào)節(jié)針刺鎮(zhèn)痛。
　　生理模型側(cè)腦室注射結(jié)果顯示,EA+Tβ4組大鼠TFL顯著低于EA+PBS組大鼠TFL(p＜0.05)。在炎