神經(jīng)機(jī)械性損傷中腦紅蛋白表達(dá)及作用的研究.pdf

1、氧是生命活動(dòng)的基本物質(zhì)之一，而氧的代謝和利用一直是生命科學(xué)研究中的活躍領(lǐng)域。眾所周知，人體內(nèi)存在兩種與氧密切相關(guān)的球蛋白：血紅蛋白(hemoglobin，HGB)和肌紅蛋白(myoglobin，MGB)。它們是機(jī)體實(shí)現(xiàn)氧的儲(chǔ)存、利用、轉(zhuǎn)運(yùn)、線(xiàn)粒體有氧活動(dòng)及活性氧的清除等過(guò)程中的重要載體。成人腦雖然僅占體重的2％，但其有氧代謝非?；钴S，耗氧量占人體總耗氧量的20％左右。那么神經(jīng)系統(tǒng)中是否存在一種特異性的攜氧蛋白以促進(jìn)腑的氧和能量代謝呢?這

2、一問(wèn)題激起了科研工作者的廣泛興趣。2000年Burmester[1]等首次報(bào)道，脊椎動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)存在第三種單體攜氧珠蛋白--腑紅蛋白(neuroglobin，NGB)，它在皮層神經(jīng)元及視網(wǎng)膜中呈高表達(dá)，提示其可能參予了神經(jīng)系統(tǒng)氧與能量的代謝活動(dòng)，為神經(jīng)系統(tǒng)氧利用的研究帶來(lái)新的曙光。已有的研究結(jié)果顯示[2-6]：缺氧可以誘導(dǎo)NGB表達(dá)上調(diào)，同時(shí)，高表達(dá)NGB有助于神經(jīng)組織耐受缺氧損傷，而抑制NGB農(nóng)達(dá)則會(huì)加重其損傷程度。以上研究為NGB

3、作為內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)因子提供了論據(jù)，為治療缺氧性神經(jīng)損傷提供了新思路。 在神經(jīng)外科的臨床工作中，顱腦創(chuàng)傷是最常見(jiàn)的病種之一。創(chuàng)傷后腦組織水腫，對(duì)氧的攝取和利用明顯下降是引起腦損傷的重要因素。而NGB作為神經(jīng)系統(tǒng)特有的攜氧球蛋白，研究其在神經(jīng)系統(tǒng)機(jī)械性損傷中的表達(dá)和作用，將為臨床工作中對(duì)顱腦創(chuàng)傷的診斷、治療提供新的契機(jī)和切入點(diǎn)。本研究包括： 1、建立體外培養(yǎng)原代神經(jīng)元機(jī)械性損傷模型：手術(shù)取胎鼠大腦皮層，分離純化后作原代神經(jīng)元

4、培養(yǎng)：用抗神元特異性蛋白--神經(jīng)絲蛋白(Neurofilament protein，NF)抗體鑒定細(xì)胞純度；對(duì)Banker體外損傷模型進(jìn)行改良，采用自行設(shè)計(jì)的模版對(duì)培養(yǎng)神經(jīng)元進(jìn)行機(jī)械性損傷，并在損傷后行光鏡下觀(guān)察及免疫組化檢測(cè)c-Fos蛋白來(lái)證實(shí)神經(jīng)元的損傷。 2、分別采用免疫組織化學(xué)、Western Blot技術(shù)檢測(cè)神經(jīng)元損傷后NGB的表達(dá)變化：神經(jīng)元NGB染色采用鏈霉素抗生物素-過(guò)氧化物酶連接法(SP法)，并采用圖像分析技術(shù)

5、(Image J軟件，美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生院-NIH)觀(guān)測(cè)損傷前、后不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)元的NGB免疫組化反應(yīng)陽(yáng)性信號(hào)的灰度值：細(xì)胞裂解提取蛋白后，采用Western Blot技術(shù)檢測(cè)神經(jīng)元損傷前、后各時(shí)間點(diǎn)NGB的表達(dá)。兩種檢測(cè)方法的結(jié)果一致。 3、增加NGB的表達(dá)對(duì)損傷神經(jīng)源性細(xì)胞活性的影響：因神經(jīng)元的轉(zhuǎn)染率低，因而采用轉(zhuǎn)染率高的神經(jīng)源性細(xì)胞(B104細(xì)胞)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。先按照損傷模型對(duì)B104細(xì)胞進(jìn)行機(jī)械性損傷，采用Western Blot

6、技術(shù)檢測(cè)B104細(xì)胞損傷后NGB的表達(dá)變化．確定其變化趨勢(shì)與原代神經(jīng)元相同；然后采用軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院二所十三室制備的pCMV-Myc-NGB質(zhì)粒轉(zhuǎn)染B104細(xì)胞，用Western Blot檢測(cè)技術(shù)驗(yàn)證B104細(xì)胞轉(zhuǎn)染pCMV-Myc-NGB質(zhì)粒后NGB表達(dá)增多；選取損傷后0.5h、2h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，分別測(cè)定并比較未轉(zhuǎn)染組、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組及pCMV-Myc-NGB質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的乳酸脫氫酶(LDH)活性及MTT細(xì)胞活性，證明了高表達(dá)NGB對(duì)機(jī)械性損

7、傷后的神經(jīng)源細(xì)胞具有保護(hù)作用。 4、大鼠急性局灶性腦損傷分級(jí)模型的建立：改進(jìn)Feeney s自由落體模型裝置并制作大鼠急性局灶性腦損傷模型，以不同沖擊力(200gcm、600gcm、1000gcm)致大鼠腦損傷，鼠腦切片后并用TTC染色，采用Image J軟件計(jì)算各組損傷后壞死腦組織的體積，經(jīng)比較存在組間差異 5、大鼠急性局灶性顱腦損傷后血清NGB的水平變化：自行制備N(xiāo)GB雙抗夾心ELISA檢測(cè)試劑盒；測(cè)定傷后輕、中、重

8、各組腦損傷血清中的NGB含量并比較差異，證明了血清中NGB水平腦損傷程度呈正相關(guān)；測(cè)定同一損傷程度下，損傷后各時(shí)間點(diǎn)血清NGB的水平，顯示了損傷后血清中NGB水平的變化趨勢(shì)。 綜上所述，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，本研究證實(shí)單純的機(jī)械性損傷可以刺激神經(jīng)元腦紅蛋白表達(dá)上調(diào)，在機(jī)械性神經(jīng)損傷中，腦紅蛋白具有神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)功能，為基于此保護(hù)機(jī)制研發(fā)新的神經(jīng)保護(hù)藥物用于腦損傷的治療提供了依據(jù)；通過(guò)在體實(shí)驗(yàn)，初步證明腦損傷后血清NGB水平與損傷程度的關(guān)系