中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)P2X3受體在電針鎮(zhèn)痛中的作用.pdf

1、疼痛對人類健康危害極大,因此對疼痛機制的探索一直是臨床醫(yī)學(xué)和神經(jīng)科學(xué)研究的熱點和難點。慢性神經(jīng)痛繼發(fā)于外周或中樞神經(jīng)損傷,表現(xiàn)有自發(fā)痛(spontaneouspain),痛覺過敏(hyperalgesia)以及觸誘發(fā)痛(allodynia)等。細(xì)胞外的三磷酸腺苷(adenosine5'-triphosphate,ATP)通過與細(xì)胞膜上嘌呤受體(purinoceptors)結(jié)合,促進疼痛在外周和中樞的傳遞,其中P2X3受體亞型是嘌呤受體中

2、一個主要傳遞疼痛信息的受體。中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)(midbrain periaqueductal gray,PAG)在疼痛信息傳遞中處于承上啟下的關(guān)鍵部位,是機體內(nèi)源性疼痛調(diào)制系統(tǒng)(endogenous pain modulatory system)的一個重要組成部分,高位中樞神經(jīng)系統(tǒng)對疼痛信息的調(diào)制往往都通過對PAG功能的調(diào)節(jié)而實現(xiàn)。在東方國家,電針(electroacupunctum,EA)廣泛運用于慢性疼痛的臨床治療已有2000多年

3、歷史,療效可靠,但是一直以來對電針鎮(zhèn)痛機理尚不明確,在一定程度上阻礙了電針治療的臨床運用和推廣。
　　 目的:(1)觀察Sprague-Dawley(SD)大鼠在外周神經(jīng)慢性結(jié)扎性損傷(chronicconstriction iniury,CCI)手術(shù)所引發(fā)慢性神經(jīng)痛前后熱痛閾、機械痛閾的變化和中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)外側(cè)部(lateral midbrain periaqueductal gray,1PAG)中P2X3受體表達(dá)變化。(

4、2)通過在慢性神經(jīng)痛大鼠(以下稱:CCI大鼠)1PAG微量注射P2X3受體的激動劑和特異性阻斷劑,觀察CCI大鼠熱痛閾和機械痛閾的改變。(3)對CCI大鼠進行多次穴位電針治療,觀察電針治療前后,CCI大鼠熱痛閾和機械痛閾的改變以及1PAG中P2X3受體表達(dá)變化,探討1PAG中P2X3受體表達(dá)與電針鎮(zhèn)痛的關(guān)系,為臨床電針治療慢性神經(jīng)痛提供新的理論依據(jù)。
　　 方法:(1)建立SD大鼠慢性右側(cè)坐骨神經(jīng)結(jié)扎性損傷模型,通過輻射熱實驗(

5、radiant heat test)和von Frey纖維絲實驗(von Frey filaments test)檢測大鼠在神經(jīng)損傷前后,建模側(cè)后肢熱痛閾(thermal withdrawal latency,TWL)和機械痛閾(mechanicalwithdrawal threshold,MWT)的變化,通過免疫組織化學(xué)技術(shù)觀察1PAG中P2X3受體表達(dá)的變化以及通過免疫印跡技術(shù)觀察1PAG中P2X3蛋白水平變化;(2)通過對CCI大

6、鼠中腦1PAG微量注射P2X3受體的特異性阻斷劑A-317491阻斷1PAG中P2X3受體功能后,在1PAG微量注射ATP的類似物α,β-亞甲基ATP(α,β-methylene-ATP,α,β-meATP),觀察CCI大鼠熱痛閾和機械痛閾變化規(guī)律;運用腦片全細(xì)胞膜片鉗技術(shù),觀察乳鼠IPAG神經(jīng)元的α,β-meATP誘發(fā)放電和A-317491對α,β-meATP誘發(fā)放電的影響;(3)在CCI大鼠建模側(cè)“足三里”和“三陰交”穴給予多次電針

7、刺激,觀察電針治療前后大鼠熱痛閾和機械痛閾以及1PAG中P2X3受體表達(dá)變化;(4)用針對P2X3基因的反義寡聚核苷酸(oligodeoxynucleotide,ODN)腦內(nèi)微量注射降低1PAG中P2X3mRNA表達(dá)后,觀察對“足三里”穴位電針治療鎮(zhèn)痛作用的影響,以探討電針治療和1PAG中P2X3受體表達(dá)的關(guān)系。
　　 結(jié)果:(1)通過對SD大鼠疏松結(jié)扎右側(cè)坐骨神經(jīng)后成功復(fù)制出慢性神經(jīng)痛動物模型,建模成功大鼠的熱痛閾和機械痛閾均

8、下降,CCI術(shù)后第14天熱痛閾和機械痛閾下降至最低值,14天后熱痛閾和機械痛閾均有小幅緩慢上升但與正常大鼠熱痛閾和機械痛閾比較差異仍有統(tǒng)計學(xué)意義。(2)CCI大鼠中腦PAG中P2X3受體陽性表達(dá)與正常大鼠以及假手術(shù)大鼠比較有輕度上調(diào),主要陽性表達(dá)部位在1PAG,同時1PAG中P2X3受體蛋白水平與正常大鼠和假手術(shù)大鼠比較也有輕度升高。(3)在1PAG微量注射ATP類似物α,β-meATP后,與注射前比較,CCI大鼠熱痛閾和機械痛閾值有明

9、顯升高;當(dāng)用P2X3受體的特異性阻斷劑A-317491在IPAG微量注射進行預(yù)處理后,α,β-meATP的痛閾升高效果明顯減弱,熱痛閾和機械痛閾值升高幅度減少,有統(tǒng)計學(xué)意義。(4)α,β-meATP可使乳鼠1PAG神經(jīng)元放電頻率增加,P2X3受體特異性阻斷劑A-317491可抑制此作用;(5)在CCI大鼠“足三里”和“三陰交”穴位給予多次電針刺激后,伴隨P2X3受體在CCI大鼠1PAG表達(dá)上調(diào),CCI大鼠痛閾明顯升高;相反,對CCI大鼠

10、進行“非穴位”電針,P2X3受體在1PAG表達(dá)無明顯變化,CCI大鼠痛閾改變無統(tǒng)計學(xué)意義;(6)當(dāng)用針對P2X3基因的反義寡聚核苷酸1PAG微量注射降低P2X3受體在1PAG中表達(dá)后,“足三里”穴位電針對CCI大鼠的鎮(zhèn)痛效果明顯下降。
　　 結(jié)論:(1)外周神經(jīng)(坐骨神經(jīng))損傷可導(dǎo)致SD大鼠熱痛閾和機械痛閾值下降,CCI大鼠1PAG的P2X3陽性表達(dá)上升;(2)1PAG微量注射α,β-meATP可引起CCI大鼠熱痛閾和機械痛閾值

11、的顯著性升高,此作用可因微量注射P2X3受體的特異性阻斷劑A-317491預(yù)處理而減弱;同時A-317491對1PAG神經(jīng)元α,β-meATP誘發(fā)電流有抑制作用。(3)對CCI大鼠“足三里”穴位給予7次電針刺激,可引起CCI大鼠熱痛閾和機械痛閾值的升高以及P2X3受體在1PAG表達(dá)的升高;對CCI大鼠“非穴位”進行7次電針,不能引起痛閾升高和。P2X3受體在1PAG表達(dá)變化;(4)在1PAG多次微量注射針對P2X3基因的反義寡聚核苷酸后